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 JoVE Biology

Dissezione del rene Zebrafish adulti

*1, *1, 1

1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

* These authors contributed equally
Article
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    Summary

    Il rene zebrafish è la patria di entrambi renale ematopoietiche adulte e cellule staminali / progenitrici, e rappresenta una straordinaria opportunità per studiare questi tipi di cellule e la loro progenie in un organismo modello vertebrato. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata dissezione che consente al ricercatore di identificare e rimuovere chirurgicamente il rene adulto pesce zebra, che può essere utilizzata per applicazioni quali l'isolamento delle cellule, il trapianto, e studi di espressione del rene e / o popolazioni di cellule del sangue.

    Date Published: 8/29/2011, Issue 54; doi: 10.3791/2839

    Cite this Article

    Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839, doi:10.3791/2839 (2011).

    Abstract

    I ricercatori che lavorano nel campo in rapida crescita della biologia delle cellule staminali adulte cercano di capire i segnali che regolano il comportamento e la funzione delle cellule staminali durante la normale omeostasi e stati di malattia. La comprensione delle cellule staminali adulte ha implicazioni di vasta portata per il futuro della medicina rigenerativa 1. Per esempio, una migliore conoscenza della biologia delle cellule staminali adulte possono facilitare la progettazione di strategie terapeutiche in cui vengono attivati ​​gli organi di guarire se stessi o addirittura la creazione di metodi per la coltivazione in vitro organi che possono essere trapiantati nell'uomo 1. Il pesce zebra è diventato un modello animale potente per lo studio della biologia delle cellule dei vertebrati 2. C'è stata una vasta documentazione e analisi dello sviluppo embrionale del pesce zebra 3. Solo di recente gli scienziati hanno cercato di documentare anatomia adulto e le tecniche di dissezione chirurgica 4, in quanto vi è stato un movimento progressivo all'interno della comunità zebrafish di ampliare le applicazioni di questo organismo di ricerca per gli studi per adulti. Per esempio, ci sono interessi in espansione con zebrafish per studiare la biologia delle popolazioni di cellule staminali adulte ed effettuare sofisticati modelli adulti di malattie come il cancro 5. Storicamente, l'isolamento del rene adulto zebrafish è stato fondamentale per lo studio ematopoiesi, come il rene è la posizione anatomica della produzione di cellule del sangue nei pesci 6,7. Il rene è composto da unità funzionali nefrone trovato negli accordi arborized, circondato da tessuto emopoietico che è dispersa in tutto il spazi. La componente ematopoietiche consiste di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e la loro progenie che abitano il rene fino a quando non terminali differenziare 8. Inoltre, è ora apprezzato il fatto che un gruppo di renale cellule staminali / progenitrici (RPC) abitano anche l'organo zebrafish rene e permettere sia la rigenerazione del rene e la crescita, come osservato in altre specie di pesci 9-11. Alla luce di questa nuova scoperta, il rene zebrafish è un organo che ospita la sede di due interessanti opportunità per gli studi di biologia delle cellule staminali adulte. E 'chiaro che molte questioni in sospeso potrebbe essere ben servita con questo sistema sperimentale. Per favorire l'espansione di questo campo, è utile per documentare i metodi dettagliati di visualizzare e poi isolare l'adulto organo rene zebrafish. Questo protocollo dettagli la nostra procedura per la dissezione del rene adulto da animali sia non fissati e fissi. Dissezione del rene organo possono essere utilizzate per isolare e caratterizzare le cellule staminali ematopoietiche e renale e la loro prole nell'utilizzo di tecniche consolidate quali l'istologia, la fluorescenza cell sorting attivato (FACS), 11,12, 13,14 profili di espressione, e il trapianto 11,15. Ci auguriamo che la diffusione di questo protocollo sarà fornire ai ricercatori le conoscenze necessarie per realizzare un più ampio utilizzo degli studi di zebrafish che alla fine può essere tradotto per l'applicazione sull'uomo.

    Protocol

    1. La dissezione del rene adulto zebrafish da un campione animale unfixed

    1. Selezionare un zebrafish adulti tra i 3-6 mesi di età per la dissezione.
    2. Euthanize il pesce mettendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7,0 per circa 4-5 minuti, guardando con attenzione per vedere che le branchie si fermano e il cuore smette di battere.
    3. Con un cucchiaio, sollevare il pesce dal bagno Tricaine in una piccola quantità di soluzione, decantare la soluzione e delicatamente posto l'animale su un tovagliolo di carta.
    4. Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per rimuovere la testa dell'animale, effettuando un taglio subito dietro l'opercolo branchiale (Figura 1, percorso A). Scartare la testa in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
    5. Utilizzare le forbici dissezione per aprire il corpo dell'animale, facendo una lunga incisione ventrale, a partire dalla testa e chiude in coda alla base della pinna caudale (Figura 1, percorso B).
    6. Rimuovere gli organi interni dell'animale utilizzando un paio di pinzette dissezione / pinze, e metterli in rifiuti biologici. Fare attenzione a non spazzolare la parete dorsale del corpo, in quanto questa è la posizione del rene (Figura 2). Se è stato selezionato un pesce femmina, sarà necessario raccogliere le uova sviluppo fuori della cavità del corpo, che può essere più facile da fare usando una coppia di pinze ad angolo o una pinzetta.
    7. Utilizzare aghi dissezione al pin aprire le pareti del corpo di un vassoio di dissezione, e l'angolo i perni in modo che il rene possono essere visualizzati. Il rene possiede una forma caratteristica (testa, tronco / sella, coda) e colore, si alternano con pigmentazione color nero (Figura 2). Si può anche vedere l'aorta pieno di sangue periferico, che corre lungo la linea mediana della struttura dell'organo.
    8. Utilizzare una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale del corpo, utilizzando un paio di pinze per sollevare il rene come organo separato dal tessuto connettivo che ne sono alla base.
    9. Posizionare con delicatezza il rene nel veicolo desiderato per ulteriori studi sulle cellule vive, come una provetta contenente PBS 1x per la preparazione FACS.

    2. Preparazione e dissezione del rene adulto zebrafish da un campione di animali fisso

    1. Preparare una soluzione del 4% PBST paraformaldehyde/1X. Far bollire la soluzione per sciogliere il PFA in soluzione, poi raffreddare il composto a 4 ° C e aggiungere 0,1% dimetilsolfossido. Abbiamo avuto più successo con la conservazione dei tessuti da usare appena fatto soluzioni PFA al contrario di aliquote congelate. Preparare la soluzione sufficiente per immergere il pesce zebra adulto durante la dissezione.
    2. Riempire un vassoio di dissezione con una soluzione di fissaggio sufficiente per immergere il pesce zebra adulto durante la dissezione. Eseguiamo i passaggi successivi con questo vassoio posizionato sotto il microscopio, che può essere collocato in una cappa chimica per minimizzare l'esposizione agli odori fissazione.
    3. Selezionare un zebrafish adulti tra i 3-6 mesi di età per la dissezione.
    4. Euthanize il pesce mettendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7,0 per circa 5 minuti, guardando con attenzione per vedere che le branchie e smettere di battere il cuore.
    5. Con un cucchiaio, sollevare il pesce dal bagno Tricaine in una piccola quantità di soluzione, decantare la soluzione e delicatamente posto l'animale su un tovagliolo di carta.
    6. Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per rimuovere la testa dell'animale, effettuando un taglio subito dietro l'opercolo branchiale (Figura 1, percorso A). Scartare la testa in un contenitore per rifiuti rischio biologico, e subito posto l'animale in PFA-vassoio contenente dissezione.
    7. Utilizzare le forbici dissezione per aprire il corpo dell'animale, facendo una lunga incisione ventrale, a partire dalla testa e chiude in coda alla base della pinna caudale (Figura 1, B percorso), e mantenere il corpo parzialmente sommerso durante la procedura.
    8. Rimuovere gli organi interni dell'animale utilizzando un paio di pinzette dissezione / pinze, e metterli in rifiuti biologici. Fare attenzione a non spazzolare la parete dorsale del corpo, in quanto questa è la posizione del rene (Figura 2).
    9. Utilizzare aghi dissezione al pin aprire le pareti del corpo, e l'angolo i perni in modo che il rene possono essere visualizzati. Il rene possiede una forma caratteristica (testa, sella, coda) e colore, si alternano con pigmentazione color nero (Figura 2). Si può anche vedere l'aorta pieno di sangue periferico, che corre lungo la linea mediana della struttura dell'organo.
    10. Fissare il campione durante la notte, mettendo il vassoio a 4 ° C quando si è fatto a organizzare i campioni desiderati.
    11. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione PFA dal vassoio e sostituirlo con 1x PBST.
    12. Utilizzare una pinza sottile per staccare con cura il rene dalla parete dorsale del corpo, utilizzando un paio di pinze per sollevare il rene come organo separato dal tessuto connettivo che ne sono alla base. Il tessuto renale sarà morbida e flessibile dal DMSO nella soluzione di fissativo, che consente di sezionare l'intero organo rene in un unico pezzo.
    13. Utilizzare un ampioforo pipetta di trasferimento per posizionare il rene in una provetta.
    14. Il rene può essere ulteriormente elaborato per condurre montare istologica o intero negli studi di espressione genica in situ sulla base dello studio desiderato.

    3. Rappresentante dei risultati:

    I passi che vengono rappresentata nella Figura 1 indicano la procedura di dissezione. Il rene può essere identificato in base alla sua caratteristica forma e colorazione, e la posizione anatomica sulla parete dorsale della cavità del corpo dell'animale, come mostrato nella Figura 2. Dopo la dissezione di un campione fisso rene, montare tutto ibridazione in situ possono essere utilizzate per localizzare l'espressione di un gene di interesse, come mostrato nella Figura 3.

    Figura 1
    Figura 1: Procedura che consente l'accesso diretto per sezionare il pesce zebra rene adulto. (A) zebrafish eutanasia è sezionato in modo graduale (indicato da numeri e frecce) per dare al ricercatore il più facile accesso al rene organo completo. Le immagini della cavità addominale prima (B) e dopo (C) la rimozione degli organi addominali.

    Figura 2
    Figura 2:. Visualizzazione del rene zebrafish in un campione unfixed dopo la rimozione di organi nella cavità del corpo, il rene appare come un unico organo appiattito che è aderente alla parete dorsale del corpo attraverso i tessuti connettivi (A), ed è stato schematizzato (B) per mostrare la sua forma anatomica.

    Figura 3
    Figura 3: montare intero ibridazioni in situ effettuata su tutto l'organo rene adulto. (A) cadherin17 trascrizioni vengono rilevati nel tubulo di nefroni rene adulto, ampliato nel (A '). (B) trascrizioni mafba sono localizzate nefrone prossimale tipi di cellule nel rene adulto (confronta con tubulo intero pannello A). (B' ) Una visione allargata di espressione mafba rivela che le trascrizioni sono specificamente localizzati al podociti (P), le cellule del sangue filtro (glomerulo) e contorto tubulo prossimale (PCT).

    Discussion

    Le cellule staminali adulte sono componenti dinamici ed essenziali che mantengono la forma adulta del corpo 1. Le cellule staminali adulte possono anche servire per contrastare i danni che il corpo subisce durante stati di malattia, e la disfunzione o la perdita di cellule staminali adulte possono portare al declino della funzione dell'organo ed è stata coinvolta a guidare neoplasie maligne del cancro e contribuiscono all'invecchiamento. Le cellule staminali adulte presentano proprietà cellulari che li distinguono dagli altri tipi di cellule differenziate. Al momento della divisione cellulare, le cellule staminali adulte sono in grado di auto-rinnovamento e la produzione di cellule progenitrici che a sua volta può dare origine a diversi prole differenziata. C'è un grande interesse nella comprensione dei percorsi che regolano le decisioni il destino delle cellule e la potenza delle cellule staminali adulte per la loro importante ruolo nella omeostasi dei tessuti 1. Per esempio, molti scienziati oggi cercano di identificare i segnali che mantengono diverse popolazioni di cellule staminali adulte nella loro nicchia, o microambiente specializzati e di nicchia come questo è influenzato da fattori umorali.

    Cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono cellule pluripotenti che alimentano il continuo ringiovanimento delle cellule del sangue negli animali 8. Emopoiesi è un processo vibrante che è costantemente in corso durante la vita di un organismo vertebrato perché la differenziata tipi di cellule mature del sangue sono di breve durata e, quindi, devono essere alimentati regolarmente. Come si dividono, CSE fornire questa domanda cruciale da auto-rinnovamento e producendo una serie di progenitori che danno origine alla eritroidi, lignaggi megacariociti, linfoide e mieloide. Ognuno di questi tipi di cellule del sangue svolge funzioni uniche nella circolazione, compresa la fornitura di scambio di gas nei tessuti, un modo per sigillare le lesioni ai vasi sanguigni per mezzo di formazione di coaguli, o meccanismi di difesa contro i patogeni. Mentre le CSE sono stati riconosciuti da molti anni, una pletora di affascinanti domande rimangono senza risposta su queste cellule sorprendente. Studi recenti hanno identificato sottoclassi di cellule staminali con differenti a lungo termine di auto-rinnovamento proprietà, e la spiegazione dei componenti di nicchia e di segnali che modulano il comportamento HSC 8. Il pesce zebra è ora tra i capisaldi della ematopoiesi paradigmi di ricerca, in base agli attributi genetici e molecolari di questo modello animale 8. Ricerca utilizzando il pesce zebra ha portato a nuove intuizioni sulla biologia HSC che si conservano con maggiore vertebrati come i mammiferi, sottolineando la rilevanza biomedica di indagini del sangue di pesce 8.

    Storicamente, la conoscenza di CSE ha aperto la strada per le spedizioni che cercano di scoprire se altri organi del corpo sono mantenuti da cellule staminali adulte. Numerose popolazioni di cellule staminali adulte sono apprezzati di esistere, che spaziano tra diverse strutture del cervello verso l'intestino, la pelle e muscolo scheletrico. Continui sforzi nel campo delle cellule staminali cercano di identificare come le cellule staminali adulte e anche altri tipi di cellule differenziate in grado di visualizzare una maggiore potenza in varie impostazioni.

    Per quanto riguarda il rene, c'è stata grande dibattito fra nefrologi se le cellule staminali renali esistono 16. Risultati indipendenti hanno documentato le popolazioni di cellule renali nei mammiferi che possiedono diversi gradi di potenziale rigenerativo, ma una comprensione coerente di queste relazioni deve essere ancora raggiunto. È interessante notare che vi è una forte evidenza per sostenere l'idea che molte specie di pesci possiedono cellule che possono robustamente carburante rigenerazione dei nefroni danneggiato, così come crescono nefroni completamente nuovo durante l'età adulta 9. Studi recenti hanno identificato le caratteristiche molecolari delle cellule staminali adulte renali in zebrafish 10,11, e dimostrato l'auto-rinnovamento potenza di questi cosiddetti renale cellule staminali / progenitrici (RPC) 11. Studi futuri sono necessari per verificare se le cellule renali analoghe sono presenti nei mammiferi. Tuttavia, le indagini continua sui meccanismi cellulari e molecolari che regolano RPC pesce può fornire indicazioni sul modo in cui prodezze rigenerativa può essere stimolato nel rene dei mammiferi. E 'evidente che c'è ancora molto da comprendere circa RPC, e che tanti strumenti oggi a disposizione del ricercatore zebrafish possono essere implementate per affrontare queste domande intriganti.

    In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l'identificazione e dissezione anatomica del rene adulto zebrafish. Procedura alternativa può essere utilizzato per analizzare il rene, come l'apertura della cavità addominale con una incisione ventrale con le forbici dissezione, tuttavia, abbiamo incontrato più successo di accesso l'intero organo quando la parete addominale è bloccata aperta e la testa è stata rimossa. Ricercatori del sangue e dei reni sia che vogliono isolare e lavorare con questi tipi di cellule possono utilizzare entrambi i metodi dissezione. Va notato che il metodo descritto per isolare e working con il rene adulto zebrafish non è certo limitato agli scienziati che intendono esercitare le domande di biologia delle cellule staminali adulte, come la dissezione di questo organo può facilitare gli studi di quei ricercatori che perseguono ricerche su argomenti che spaziano dalla fisiologia alla invecchiamento. Inoltre, questo metodo può essere accoppiato con altre tecnologie come transgenici, in modo da etichetta molecolare e poi purificare e studiare sottopopolazioni discreto di cellule del sangue o dei reni dal tipo selvatico o geneticamente mutante zebrafish 11. Guardando al futuro, quali le procedure di purificazione dettagliata dei tipi di cellule staminali e cellule progenitrici è fondamentale per acquisire conoscenza su come il loro comportamento è regolato, come i test operativi come il trapianto o la coltura progenitrici costituiscono la base dalla quale la potenza e l'identità di queste cellule è definito. I recenti progressi nei metodi di coltura progenitrici ematopoietiche aperto molte nuove strade per lo studio, e può essere adattato a coltura delle popolazioni renale 17. Zebrafish genetica chimici sono riusciti ad individuare dei percorsi che modulano le CSE e progenitori renali nei diversi contesti 18-20, e continuerà ad essere una strada utile per testare in combinazione con le tecniche sopra biologia cellulare. Nel loro insieme, ci sono stati una serie di contributi innovativi ai campi di ematologia e nefrologia utilizzando il modello zebrafish, e ha continuato la ricerca in questi ambiti promette di esercitare ulteriori approfondimenti trasformazione nei prossimi anni.

    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgements

    RAW vuole ringraziare i membri del Zon e Davidson laboratori di ricerca per il loro contributo di innumerevoli contribuendo a sviluppare strategie che hanno progressivamente questa forma tecnica di dissezione in zebrafish adulti nel corso dell'ultimo decennio. Inoltre, vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai membri del personale di Notre Dame Centro per la Ricerca Zebrafish per fornire un'eccellente assistenza continua di allevamento per la nostra colonia zebrafish. RAW ha raccolto fondi per la ricerca del NIH-NIDDK DK083512 di assegnazione del contributo, e di laboratorio generosi finanziamenti di avviamento presso l'Università di Notre Dame.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
    Dissection forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
    Dissection angled forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5058
    Tricaine Sigma-Aldrich E10521
    Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210

    References

    1. Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
    2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
    3. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
    4. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
    5. Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
    6. Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
    7. Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
    8. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
    9. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
    10. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
    11. Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
    12. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
    13. Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
    14. Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
    15. Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
    16. Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
    17. Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
    18. North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
    19. Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
    20. de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).

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    1 Comment

    Gud Job...thanks and Congratulations
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    Posted by: AnonymousFebruary 7, 2012, 1:22 AM

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