新型抗癌药物使用手术标本肿瘤植的发展方法

Joshi, K., Demir, H., Yamada, R., Miyazaki, T., Ray-Chaudhury, A., Nakano, I. Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (53), e2846, doi:10.3791/2846 (2011).

恶性胶质瘤目前的治疗方法只治标不治本的效果。治疗发展的一个障碍是由目前的药物的疗效试验和对患者的疗效确定的疗效差异。因此，评价药物疗效的新的和可靠的方法是必要的临床前研究阶段。，肿瘤组织，包括细胞株 ，在体外培养的癌细胞大量的表型，遗传和表观遗传的细胞培养人工环境所造成的改变，这可能没有反映在原地的原发肿瘤生物学。免疫缺陷小鼠移植瘤模型也有其局限性，即缺乏免疫系统和物种间的遗传和表观遗传在微环境的差异。在这里，我们展示了一种新的方法使用未解离肿瘤块恶性胶质瘤的手术标本，以评估治疗效果。为了验证这种方法，目前第一线化疗药物，替莫唑胺（TMZ），的数据进行了阐述。

我们用我们的实验恶性胶质瘤新鲜取出手术标本。 TMZ网站或其他候选药物孵化和手术切除标本的分析，我们进行瘤内注射。在这里，我们试图建立一个肿瘤组织块法作为一个平台，以确定新型抗癌疗法的疗效，使我们能够克服，至少当前的一些限制，并填补目前的实验存在的差距数据和实际的病人的肿瘤的疗效。这种方法可能有可能加速确定新的化疗药物的固体癌症治疗。

1。介质的制备

1. 媒体准备用10％胎牛血清（16140-071 - GIBCO公司）DMEM/F-12（1X），液体1:1（10565-042 - Invitrogen公司）0.6％的琼脂溶液纯净，颗粒（1.01614.1000 - EMD的）。无菌条件下均保持在整个实验过程。
2. 对于媒体胎牛血清5ML准备（16140-071 - GIBCO公司）加入到45mL的DMEM/F-12（1X），液体1:1（10565-042 - Invitrogen公司）50ml的最终体积。准备媒体在37 ° C的温度保持在水浴。
3. 琼脂溶液准备用热微波法。颗粒状的琼脂0.3克，溶解于50ml蒸馏水，利用微波水。琼脂溶液降温至37 ° C的温度保持水浴。
4. 我们用同等体积的1.2和1.3的步骤和准备原液媒体。的0.6％的琼脂（0.5ML）和10％FBS-D-MEM/F-12媒体（0.5ML）比例是1:1，在每孔6孔板的总体积为1 mL。

2。组织处理

1. 胶质母细胞瘤（GBM）的组织，共收到后立即手术病理科。从病理学教研室组织被列为大紫荆勋章。
2. patri板使用镊子小心被转移到组织和冰冷5ML 1XPBS洗3次。
3. 从解剖样品切取的标本连续切片，创建瘤块，用手术刀片（羽毛- 2976＃10）和forcep（Fisher Scientific这）（直径约10毫米）。
4. 块被转移到一个6孔板。每个井1ml含媒体提到在步骤1.4。该组织有足够的暴露在空气中不断组织可行的。
5. 瘤块，然后注射DMSO（5％）或TMZ网站（2.5纳米），16小时在37℃，含5％CO2的加湿空气。 0.1ml的二甲基亚砜（5％）或TMZ的瘤块注射3次，一致的方式处理不同的地方。这种药物被注射使用胰岛素注射器1ML 0.37X12.7mm 28G1 / 2（点安慰- 26027）。
6. 16小时后洗净，用5 ml的3倍1XPBS。洗涤后的块固定与10毫升10％V / V 24小时，福尔马林50毫升管（Ricca化学公司）（BASIX - 5539802）和嵌入式4μm的部分石蜡处理。
7. 福尔马林固定部分是放置在烧杯中搅拌板与“无热”，并通过30分钟，在每一个解决方案下面的解决方案处理。 30％乙醇，50％的乙醇，75％的乙醇，80％乙醇，95％的乙醇，100％的乙醇，二甲苯等。
8. 组织抹杀纸巾和30分钟（58至60 ° C，费舍尔Paraplast石蜡）放置在熔化的石蜡。
9. 模具在使用Surgipath蓝丝带石蜡包埋，组织包埋组织被冷却到室温。
10. 石蜡包埋4μm的组织切片和费舍尔加幻灯片上。

3。免疫组织化学

免疫组织化学，如前面所述。

1. Deparaffinization和补液放置在机架的幻灯片，并执行以下步骤。二甲苯3X5分钟（5分钟的3倍），三五分钟的100％乙醇，95％为1X5分钟乙醇，70％乙醇为1X5分钟，运行3分钟自来水冲洗。
2. 抗原修复与热诱导的抗原表位的检索沉浸在1X在一个玻璃烧杯中的蒸馏水稀释的柠檬酸缓冲液（Thermo Scientific的AP9003 - 500）的幻灯片。煮沸15分钟上的一个热点板块（确定部分唐“T脱落幻灯片）。冷却30分钟，在室温下的解决方案。冲洗用1X PBS三五分钟的幻灯片。
3. 抑制过氧化内部沉浸在15分钟的玻璃烧杯中，用0.3％过氧化氢（费舍尔在蒸馏水科学BP2633 - 500稀释）在甲醇中的幻灯片（费舍尔科学- A - 452 - 4）。在1X PBS冲洗3X5分钟。
4. 封锁覆盖10％正常山羊血清组织。在潮湿中传输的幻灯片和1小时在室温下孵育。三五分钟，用1X PBS清洗的幻灯片。
5. 主要抗体孵育4 ° C的主要抗体在以下浓度：人类特定的Caspase - 3（1:1,000，研发系统，AF835），Ki67的（1:1，Dako公司，15626）与1X PBS稀释过夜。冲洗1X PBS于翌日3X10分钟的幻灯片。
6. 二次抗体反应封面用2-3滴HRP标记二抗（设想系统）的组织。在潮湿中的幻灯片和1小时在室温下孵育。用1X PBS清洗3X10分钟。
7. 检测发展为显色DAB试剂盒（载体实验室- SK - 4100）的初级抗体的检测，按照制造商的协议。
8. 反染色沉浸与苏木幻灯片（10-15小号 econds，确保不“T溢出民建联信号），运行3分钟自来水冲洗。
9. 脱水沉浸在下列顺序幻灯片，70％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，三五分钟100％的乙醇，二甲苯为3X5分钟。
10. 盖玻片permount安装试剂（费舍尔科学SP - 15 - 100）的幻灯片。
11. 使用奥林巴斯的荧光显微镜（DP - 72）.3.11）。在所有的实验，证实了特定的标签无一抗阴性对照。

4。代表性的成果：

我们收集的多形性胶质母细胞瘤（GBM）的手术切除标本。患者接受第一次手术前化疗不包括替莫唑胺（TMZ）。 MRI的T1加权图- 1A钆增强的形象展示在正确的术前额叶增强肿瘤。术后的图像（图1B）确认次全切除手术后的病变。手术组织被送往病理部临床诊断的目的，并根据批准的机构审查委员会（IRB）在美国俄亥俄州立大学医学中心的协议处理，其余标本组织采购。苏木精和曙红染色（H＆E）表现出坏死的存在，pseudopallisading细胞及微血管增生（图1 - C）。因此，这些肿瘤的病理诊断为大紫荆勋章。值得注意的是，以下没有TMZ网站的潜伏期长达48小时的肿瘤外植体保持GBM的细胞结构。与此相反，潜伏期为72小时或更长的时间，我们注意到，在标本的凝结核数量增加，这表明一些肿瘤细胞开始发生凋亡。因此，潜伏期较长的肿瘤组织中，失去了肿瘤细胞，这是优先观察及其周围坏死区（数据未显示）的片状区域。

为了调查，如果这些肿瘤的外植体样品能够可靠地使用药物的疗效试验的目的，我们测试了TMZ的治疗效果。图2表示在这项研究中的实验流程。最近的一项研究表明，TMZ的瘤内注射对恶性胶质瘤的生长控制效果比全身给药对这种药物^的 2更有效。经过16小时的潜伏期，这些外植体嵌入石蜡连续切片染色准备。 TMZ治疗GBM的组织免疫组织化学Ki - 67的阳性肿瘤细胞表现出与对照样品相比大幅减少。反过来，免疫组织化学凋亡标记，Caspase - 3的，没有取得任何TMZ治疗脑胶质瘤标本和对照样本（图3）之间的显着性差异。

与TMZ的治疗效果得到进一步的特点相结合，在体外培养或流式细胞仪之一植体检测。具体来说，我们试图确定对干细胞样肿瘤细胞（SCLTC）的影响。因此，下列与TMZ网站瘤的治疗，我们的表现领域形成实验和流式细胞仪检测这些肿瘤植。 TMZ治疗的标本分离成单个细胞，这些单细胞接种于低密度辅以碱性成纤维细胞生长因子和EGF的无血清培养基的96孔板（每微升1细胞或更低）。在对照组中，肿瘤从肿瘤植领域的形成7天的潜伏期后观察。鉴于这一领域的形成是一个SCLTC ^{3 4}的财产，在药物治疗肿瘤领域的改变表示SCLTC效果。同样，流量仪，分离肿瘤与细胞表面标志，CD133植进行了验证SCLTC效果。如果SCLTC在GBM的不同种类的肿瘤细胞有选择性药物治疗根除，人们可能会预测，流式细胞仪检测CD133阳性的一部分降低治疗（数据未显示）。

Figure.1磁共振图像（MRI）的病人的大紫荆勋章 。前置作业图- 1A和手术后的图- 1B的代表性人物。图- 1C是H＆E染色新鲜的大紫荆勋章的组织样本。原始的放大倍率，40X。

图。 2块培养实验的实验流图- 2A 。从病理学系的新鲜手术大紫荆勋章的图片。图2b显示了剥离瘤块，成与帮助手术刀片的10mm小块。图- 2C的药物（TMZ）治疗使用胰岛素注射器的瘤块。

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图。 3免疫组织化学 ，免疫组织化学与DMSO或TMZ网站注入与激活Caspase - 3和Ki67的GBM的组织块。苏木被用于核染色。原始的放大倍率，40X。

在目前的临床前实验模型的药物疗效和患者的疗效之间有一个差距。更具体地说，在脑肿瘤的研究领域，新的和可靠的方法，这将有助于填补之间存在的差距与当前方法的药物评价和患者的疗效。在这项研究中所描述的实验是一种额外的资产，如果没有一个解决方案，以方便灌装受影响的病人的实验数据和结果的差异。

优先扩大在体外细胞培养的培养条件下，无论某些肿瘤细胞类型，并表示只有一个亚群，整个肿瘤。此外，遗传和表型的人工细胞扩张发生转换，是与长期的细胞培养的必然。治疗恶性胶质瘤的主要障碍之一是肿瘤细胞的异质性，在一个单一的肿瘤和肿瘤^{样本，6，7}间，。因此，选择性富集了肿瘤细胞的某些人口，无论一种或另一种，未必是一个合适的方法来确定不同种类的肿瘤细胞化疗^{药物的疗效。8}月9日任何脑肿瘤的动物模型，从一个亚群的肿瘤细胞对药物的疗效棚灯上的一个亚群，而不是整个肿瘤。

一些局限性，另一方面，仍然在此瘤块法。一个这样的限制是相对较短的时间治疗。由于恶性肿瘤细胞被认为是获得耐大多数，如果不是全部的，随着时间的推移治疗，初步控制短期的肿瘤细胞的生长可能不能反映长期患者的预后，因为最近有报道用抗血管生成剂，贝伐单抗^10。因此，本植体的检测，以维持一段较长时间的组织协议的改进是需要进一步调查。另一个问题是测试药物在肿瘤上SCLTC的一个特定的效果。鉴于，SCLTC相对抗药性恶性胶质瘤，新型抗癌药物SCLTC是必要的，potently消除的识别目前的治疗方法。在这方面，我们目前正在寻求结合起来， 在体外实验中 ，如神经球形成实验（数据未显示），随后这个植检测。我们希望了解更多的影响，如果有的话，通过这些组合分析SCLTC的候选药物。最后，用小块的肿瘤样本可能不能反映整个肿瘤细胞群体，是与传统的肿瘤细胞株或手术切除标本的原代培养的情况下。除了这些问题，保持基质肿瘤，包括血管利基，有助于在肿瘤细胞的特征的环境因素。因此，这个实验可能具有潜在的，以评估任何一个有关生理条件下的治疗策略。

在这里，我们建立了一个与GBM的手术切除标本植药物疗效测试的检测。事实上，随着测试的手术切除标本中，我们发现了TMZ的直喷降低在GBM的样品扩散。该组织块法理论上适用于其他固体肿瘤，并提供资产，以确定药物的疗效，病人的肿瘤上，希望这将有助于我们避免癌症在临床试验再次失败。

没有利益冲突的声明。

据美国癌​​症协会（“督导小组”- 08 - 108 - 01），文森特J.丝高/美国脑瘤协会，和我野汗家庭基金会。

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