The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.16.36.153, User IP: 50.16.36.153, User IP Hex: 839918745
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice. J. Vis. Exp. (51), e2879, doi:10.3791/2879 (2011).
İnme, 1,2 2009 yılında Amerika Birleşik Devletleri 70 milyar ABD doları yakın bir tahmini maliyeti, üçüncü önde gelen ölüm nedeni ve özürlülük dünyanın önde gelen nedenidir. Koizumi 4 sıçan bu etkileyici insan patoloji simüle etmek için 1986 yılında intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli geliştirilmiştir. MCAO yöntemi bir değişiklik daha sonra Longa 3 tarafından takdim edildi. Her iki teknikte de yaygın iskemik inme ve olası tedavi yöntemleri 5 kaynaklanan beyin hasarının moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılmaktadır. Bu nispeten noninvaziv bir metod sıçanlarda, farelerde transgenik ve nakavt suşları 6,7 yararlanmak kullanmak uzatıldı . Fokal serebral iskemi modeli için, intraluminal sütür internal karotid arter yoluyla MCA tabanı kapamak için ileri düzeydedir. Katlanması zaman belirli bir süre sonra dikiş spontan reperfüzyon taklit eder, ancak sütür de kalıcı olarak muhafaza edilebilir. Bu video, kademeli bir biçimde farelerde intraluminal MCAO prosedürü gerçekleştirmek için iki ana yaklaşım gösteren yanı sıra potansiyel sakıncaları ve tuzaklar anlayışlar olacaktır. Iskemik beyin dokusu daha sonra beyin enfarktüsü 8 ölçüde değerlendirmek için 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanan olacaktır .
Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Florida Üniversitesi'nde Komitesi (IACUC) kullanın ve "Laboratuvar Hayvanları Bakım ilkesi" (NIH yayın No 86-23, 1985 revize) ile uyum içerisindedir.
1. Malzemeler
Hayvanlar: cerrahi anda 20-26 gram ağırlığında Erkek C57BL / 6 fareler (Harlan Laboratuvarları, Indianapolis, IN, ABD).
Anestezi:
Anestezi makinesi: VetEquip inhalasyon anestezi sistemi (VetEquip A.Ş., Pleasanton, CA, USA).
Fareler beyin matris dilimleme makinesi (Zivic-Miller Lab. Inc, Allison Park, PA, USA).
Dijital fotoğraf makinesi (V1253, Kodak Co, Rochester, NY, ABD).
Görüntü J yazılımı (ImageJ 1.42q yazılımı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MA, ABD).
2. Cerrahi öncesi adımlar
Ameliyat öncesinde, farelerin, su ve kemirgen yemi ücretsiz erişim ile 12:12 ışık / karanlık döngüsü altında muhafaza edilir.
(7-0 kuru izin MCAO için Dikişler, ısı ve ucundan sıvı silikon kauçuk kaplama dikiş şaft 3-4mm ile sütür ucu 1-2mm küntleşme tarafından hazırlanan; ucu çapı, 0.20-0.25mm; kaplama uzunluğunda, 3-4mm; dikiş uzunluğu 11-13mm). Sterilite, söz konusu adımların tüm korunmuş olması gerekir.
Fare ağırlığında sonra, anestezi indüksiyon odasında izofluran% 4 ile indüklenen ve% 30 O 2 ve% 70 N 2 O gaz karışımı bir yüz maskesi ile% 1.5-2 izofluran ile prosedür boyunca sürdürülmüştür.
Fare (termal battaniye) sıcaklık kontrollü bir işletim yüzey üzerinde duran bir gazlı bez üzerine yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir; baş kürk traş.
Yağ oftalmik merhem iki göz için uygulanır ve göz kapaklarının cerrahi işlemi sırasında göz kuruma önlemek için kapalı.
Nasion ve cilt esnek bir mikrotip (0.5mm çap MT B500-0 Düz mikrotip) yapıştırmayın yanal çekilir üstün ense hattan kalvaryumda örten cilt üzerinde orta hat insizyonu (1 cm) yapılır. Mikrotip lazer Doppler flowmetre MCA topraklarında kan akışını izlemek için sağ parietal kafatası yüzeyi (1 mm arka ve bregma lateral 5 mm) dik olarak yerleştirilir.
Hayvan supin pozisyonda açılmadan önce esnek mikrotip kafatasına sıkıca takılı olduğundan emin olun. Hayvanın boyun yumuşak bir yastık yerleştirilir ve burun burun konisi anestezi cihazların tutulur. Bu esnek mikrotip için yeterli alana sahip neden olacaktır.
Rektal ısı probu 37 ± 0.5 ° C sabit bir hayvan çekirdek sıcaklığını korumak için eklenir
Her iki forepaws ve hindpaws işletim platformu yüzeye bantlanmış ve kuyruk rektal tüp bantlanmış.
</ Ol>
3. MCA oklüzyonu cerrahisi:
Operasyon mikroskobu altında, orta hat boyun insizyonu gevşek deri hafifçe kaldırarak manubrium ve çene arasındaki makas ile yapılır.
In situ sol sol bezi ile eşleştirilmiş yatan submandibular bezlerin açık açık ayrılır. Sağ submandibular bezi cranially retrakte ve sternokleidomastoid kas ile birlikte güvence altına alınmıştır.
Carotica'nın kapsayan omohyoid kas maruz kalan bölümü dikkatle manyetikler ile ayrılmıştır.
Sağ karotis arter (CCA), vagus siniri ve kılıf (CCA lateralinde bulunan) dikkatlice ayrılmış ve izole edilmiştir.
Bundan sonra, farklı MCA oklüzyonu gerçekleştirmek için sık sık kullanılan 2 cerrahi yöntemler :
Koizumi Kullanıcı 4 yöntem
Üç gevşek yakalı sütür (7-0 ipek) sağ CCA etrafında hazırlanmıştır.
Eksternal karotid arter (ECA), tespit izole ve koterize (bifurkasyon için distal 2-3mm). Bu daha sonra mikro makas ile ayrılabilir. Koterizasyon yerinde yanlışlıkla periferik hasarları önlemek için, güç, güç düğmesini kullanarak 1 ayarlanmış olmalıdır. Bu tüm cauterizations için tutarlı.
Yeterli gerilim, kan akımı (kalıcı ligasyonu) CCA kapamak için en proksimal yaka dikiş uygulanır. Akış tıkanma temel kortikal perfüzyon değerlerinin ~ 50% düşüş tarafından doğrulanmadı.
Sonra bir gemi klibi arteriyotomi zaman retrograd akışını önlemek için sadece CCA çatallanma önce yerleştirilir.
Bir arteriyotomi mikro-makas (yakın ligasyonu) ile proksimal bağlandı dikiş ve CCA damar klip arasında yapılır.
Arteriyotomi ısı köreldiğini silikon kaplı 7-0 naylon sütür ile tanıştırdı ve damar klip ulaşana kadar gelişmiş. Arter duvarında travmatize dikkatli, CCA üzerinden akış kaçağı önlemek için arteriyotomi ve damar klip arasında CCA çevresinde kalan 2 gevşek yakalı sütür hafifçe sıkılır, daha sonra damar klip çekilmiş.
Longa Kullanıcı 3 yöntem
ECA, tespit koterize (1 gücü ile), (dilli ve maksiller arterlerin ayrılmasından yakınında) mümkün olduğu kadar disseke ve mikro-makas ile bölünmüş.
İki gevşek yakalı sütür (7-0 ipek) CCA çatallanma sadece yukarıda proksimal ICA çevresinde hazırlanmıştır.
CCA geçici bir gemi klibi ile kapatılır. Akış tıkanma temel kortikal perfüzyon değerlerinin ~ 50% düşüş tarafından doğrulanmadı.
Sonra ICA arteriyotomi zaman retrograd akışını önlemek için iki gevşek yakalı sütür üzerinde bir gemi klip ile geçici olarak kapatıldı.
Güdük yansıyan ECA yakın bir arteriyotomi mikro-makas kullanılarak yapılır.
ECA arteriyotomi ısı köreldiğini silikon kaplı 7-0 naylon sütür ile tanıştırdı ve ICA uygulanan damar klip ulaşana kadar gelişmiş. Proksimal ICA 2 gevşek yakalı sütür, arter duvarındaki travmatize yeterince ilgi, ICA reflü kan akışını önlemek için proksimal ICA etrafında hafifçe sıkılır, daha sonra damar klip çekilmiş.
Prosedürün geri kalanı büyük ölçüde yakınsak:
Hafif bir direnç hissedilir kadar kapatılmasıy sütür internal karotis arter (ICA) kafa tabanına doğru yavaş yavaş ilerlemiştir. Serebral kan akımı değeri başlangıca göre bir yüzdesi (% 80) olarak eşzamanlı açılan lazer Doppler flowmetre tarafından teyit edilir. 2 yaka sütür eklenen filament etrafında sıkılır.
Kapatılmasıy dikiş geçici serebral iskemi deneyleri için, 45 dakika sonra hafifçe geri çekilir. Bu zaman noktası, çeşitli deneysel amaçlar için değiştirilebilir.
Arteriyotomi sitesinde dikiş filament çekilme sonra, ameliyat sonrası kanama önlemek için kapalı. Koizumi yöntemi, bu güvenli CCA etrafında yakalı sütür sıkma içerir. Longa tekniği, ECA üssünde arteriyotomi sitesi koterize, proksimal ICA yakalı dikişlerle sonra gevşedi ve karotis akışı geri kaldırılır.
Insizyon kapatmak için, submandibular bezi ve SCM ameliyat alanın üzerine serilir. Yara kenarları sonra servikal doku yapıştırıcısı ve kafa derisi alanları ile yaklaştırılır. Alternatif olarak, emilebilen bir sütür veya metal zımba, hayvanın uzun süreli sağkalım amaçlanan, özellikle yara kapatmak için kullanılan olabilir.
Kesi kapatılmasından sonra, hayvan hacmi ikmal olarak subkutan 1 ml ılık tuzlu su alır. Iyileşme döneminde hayvanın ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için uygun analjezik doz (0.05-0.1 mg / kg 'yani Buprenorfin) kullanılmalıdır. Animal cerrahi seti kaldırıldı ve yumuşak gıda ve su ücretsiz, kolay erişim, hipotermi önlemek için sıcak bir kurtarma alan / kafes yerleştirilir.
4. Post-Op nörolojik değerlendirme
3 aşağıdaki gibi, hayvan toplam bilinç kavuşur sonra nörolojik defisit basit bir ölçek (beş puanlık bir ölçek) tarafından değerlendirilmelidir.
gözlemlenebilir açıkları yok
kontralateral forepaw (hafif fokal nörolojik defisit) genişletmek için başarısızlık
infarkt için kontralateral bir yön çizerek (orta fokal nörolojik defisit)
infarkt kontralateral bir yön düşen (ciddi fokal nörolojik defisit)
spontan hareket olmadan bilinç depresif
5. Boyama ve beyin infarkt hacmi kantitatif ölçümü
MCA reperfüzyon 24 saat sonra, hayatta kalan fare,% 4 isoflorane ile derin anestezi tartılır ve onaylanmış protokole göre kurban.
Beyin dikkatle kaldırılır ve bir fare beyin matris dilimleyiciyi yerleştirilir ve 2 mm aralıklarla tüm serebrum koronal kesitli.
Bölümleri TTC 37 fosfat tamponlu salin (PBS)% 2 ° C de 20 dakika boyunca dalmış. TTC boyama sonra, infracted alan kırmızı tuğla (canlı) doku (Şekil 1) bitişik bir beyaz (boyasız) doku olarak gösterilmiştir.
Seri bölümleri, dijital kamera ve görüntü J programı ile ölçülür infarkt alanı kullanılarak fotoğraflandı.
Infarkt alanı (beyaz, boyasız), ipsilateral hemisferde (lekeli, tuğla, beyaz ve kırmızı) alanında ve kontralateral hemisferde (kırmızı tuğla, vitray) alanında, her bölüm için ölçülür. Hacmi, tüm bölümlerde temsilcisi alanlarda toplayarak ve kesit kalınlığı ile çarpılarak hesaplanır. Ödemi düzelttikten sonra, enfarktüs hacmi 9 aşağıdaki gibi hesaplanır: Düzeltilmiş İnfarkt Hacmi (CIV),% = [kontralateral hemisfere hacmi - (ipsilateral yarımkürede hacmi - infarkt hacmi)] / kontralateral yarımkürede hacmi x 100
6. Temsilcisi Sonuçlar
Geçici serebral iskemi kurmak için sol CCA ile MCA oklüzyon ve reperfüzyon sonra, hayvanlar kurban ve onların koronal kesitli beyinleri infarkt hacmi (Şekil 1) değerlendirmek için TTC ile boyandı.
Şekil 1 fareler TTC-lekeli seri koronal beyin bölümler (2 mm) MCA oklüzyonu tabi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
MCAO model fare türlerinde serebral iskemi çoğaltır kurulmuş bir model. Bu model ilk sıçanlarda kullanılır ve bundan sonra farelere adapte oldu. Kraniektomi kaçınmak, kan-beyin bariyeri geçirgenliği ve intrakranial basınç cerrahi manipülasyonu etkisini ortadan kaldırmak için bu tekniğin bir avantaj. Ancak, ilgili gerilim farklılıkları 10, 6, oklüzyon vücut ısısı 12, anestezi 13 sütür ucu 11, süresi büyüklüğü ve diğer faktörler gibi pek çok değişken, bu model infarkt hacimleri tutarsızlık yol açabilir. Söz emri özel teknik ayrıntılar vardır:
Kaplama dikiş sonunda azalmış perforasyon riski ile MCA kapatılmasıy pürüzsüz ve yönetilebilir bir dikiş yaratacaktır.
Komşu arterlerden vagus siniri böylece yanlışlıkla İncelikli bir yaka dikiş ayrı ve güvenli sınırlı değildir. Kapatılmasıy dikiş çıkarken arteriyotomi yoluyla retrograd kanamayı önlemek için iki yaka sütür kullanımı ve arter duvarında travmatik önlemek için hafifçe sıkın emin olun.
Pterigopalatin arter bifurkasyon CCA sonra ICA uzaklaşmakta. ICA yerine pterigopalatin artere artan sütür ucu sapma önlemek için, fare, baş ve boyun düz bir yönde tutmak için cerrahi bir platform kurdu. Bu sapma, hem de Koizumi ve Longa tekniği ortak, bu yüzden her iki prosedürde dikkat edilmelidir.
Lazer Doppler flowmetre bir yöntem çeşitli anatomik bölgelerde kan akışı gerçek zamanlı izleme ve MCA yoluyla verilen beyin alanında kan akışını ölçmek için deney uygulanır. Dikiş konumlandırma doğruluğu önemli ölçüde artar ve böylece tutarlı sonuçlar elde sağlar. Bu daha az hassas anatomik varyasyon girişim duyarlı eklenecek dikiş uzunluğu ölçme teknikleri üzerinde tanınmış bir avantajdır.
CCA ve ICA aracılığıyla dikiş eklerken lazer Doppler flowmetre geçici bir artış, doğru yönde hareket ediyor sağlar ve MCA ostium yakındır.
Oksipital arterin posterolateral yönde proksimal ECA (bazen ICA rağmen) en sık ortaya çıkar. Dikiş eklerken daha sonra karışıklığı önlemek için (bazı durumlarda bağlandı) tespit edilmelidir.
Infarktüsü değişkenliği azaltmak için ameliyat sırasında fare vücut ısısını sabit tutmak ve ameliyat sonrası hipotermi önlemek için.
MCAO ameliyat sonrası 72 saat kadar uygun infarkt hacmi analiz için boyama TTC kullanın. Infarkt boyutunu belirlemek için daha uzun süre hayatta kalma süresi noktaları cresyl menekşe boyama gibi diğer boyama yöntemleri kullanın.
Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke;
a journal of cerebral circulation20 (10), 1407-1431 (1989).
Lloyd-Jones, D. et al, Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics
Subcommittee. Circulation 119 (3), e21-181 (2009).
Longa, E.Z., Weinstein, P.R., Carlson, S., & Cummins, R., Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral
circulation20 (1), 84-91 (1989).
Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., & Ooneda, G., Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in
which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke8, 1-8 (1986).
Fan, Y. et al, Endothelial progenitor cell transplantation improves long-term stroke outcome in mice. Ann Neurol67 (4), 488-497.
Fujii, M. et al, Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral
circulation28 (9), 1805-1810; discussion 1811 (1997).
Bederson, J.B. et al, Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.
Stroke; a journal of cerebral circulation17 (6), 1304-1308 (1986).
Barone, F.C., Knudsen, D.J., Nelson, A.H., Feuerstein, G.Z., & Willette, R.N., Mouse strain differences in susceptibility to cerebral
ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab 13 (4), 683-692 (1993).
Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K.A., & Dempsey, R.J., Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in
mice. Neurosurgery 56 (1 Suppl), 196-200; discussion 196-200 (2005).
Barber, P.A., Hoyte, L., Colbourne, F., & Buchan, A.M., Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and
behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation 35 (7), 1720-1725 (2004).
Kapinya, K.J., Prass, K., & Dirnagl, U., Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?
Neuroreport13 (11), 1431-1435 (2002).
1
ReplyPosted by: Hassan A.June 6, 2011, 10:17 AM