Единый Drosophila Омматидия Препарирование и обработка изображений

1. Препарирование сетчатки дрозофил

1. Заполните одну лунку 3-Ну стекло с фосфатным буферным раствором (PBS 1X), а затем анестезию пролетает CO _2. И мужчины и женщины могут быть использованы для этого эксперимента.
2. Как только мухи под наркозом, забрать одну лету с помощью щипцов и поместите его в блюдце с PBS.
3. Под рассекает сферу, щепотка хоботок щипцами, а затем отделить голову от тела разрыва шею, используя второй набор щипцов.
4. Холдинг лететь головы от хоботок, разрезанные на половинки по левой / правой средней линии летать голову microscissors выявить мозга.
5. Используйте кончик пипетки вырезать, чтобы забрать сетчатке, и трансфер второй скважины на 3-Ну стекло заполнено средой Шнайдер.
6. Во-первых, удаляйте большинство из головы кутикулы, а затем удалить мозг щипцами. Держите сетчатки зажатой между пластинкой и роговицы.
7. Далее, передача сетчатки на каплю (50 мкл) свежей среды Schnieder размещаются непосредственно на стекле.

2. Препарирование омматидии

1. В зависимости от конечной целью вскрытия (как немедленной визуализации или культуры) и на оптику флуоресцентного микроскопа (прямой или инвертированный), этот шаг может иметь место либо на предметное стекло или в 24-луночного планшета. Для конечной целью этого вскрытия, омматидии будет расчлененный непосредственно на стекло.
2. Возьмите любой самый спинной или нижним концом сетчатки щипцами. Использование microscissors, вырезать сетчатки пополам вдоль спины / вентральной срединной линии подвергать омматидиев в середине глаза.
3. Продолжить понять сетчатки, что роговица вниз, а пластинка вверх. Использование тонкой иглой вольфрама, отделить омматидиев от пластинки и роговицы.
4. Одноместный омматидиев и группы омматидиев будет собирать на дне колодца или слайд. Удалите все больше мусора, которые могут иметь собранные перед началом работы.

3. Лечение, окрашивания и обработки изображений

1. Для анализа аутофагии, разбавленных 1:1000 Lysotracker в раскрывающемся Шнайдер (первый разбавленным 1:10 в Шнейдера, а затем добавить 0,5 мкл до падения на слайде), перемешайте и подождите 10 секунд.
2. Удаление избыточной жидкости из слайдов, стараясь оставить омматидии позади. Это делается лучше всего с тонкой наконечником загрузке геля.
3. Добавить каплю Vectashield для покрытия омматидиев, применять покровное и печать с nailpolish.

4. Представитель Результаты:

Хорошее исполнение протокола должны оставить число единичных омматидиев и малых групп омматидиев хранится вместе фрагментами пластинки, но красиво разделены на роговице стороны. Они могут быть отображены как в этом примере наглядно Atg8: GFP и Lysotracker, показывая autophagosomes, лизосомы и autophagolysosomes (рис. 3). Метод может быть использован для живого изображения, однако в этом случае следует отметить, что аутофлюоресценция среднего Шнайдера будет трудно отличить низкой интенсивности флуоресцентных сигналов. Дополнительного выпуска является то, что пигментные гранулы, которые остаются прикрепленными к фоторецепторов интенсивно люминесцентные, особенно в красном канале. Картина светлого может потребоваться, чтобы отличить их от подлинных органелл.

Рисунок 1. Блок-схема вскрытия процедура получения одного омматидия или небольшие группы омматидиев от летают сетчатки.

Рисунок 2. Возможные вариации простой протокол здесь описывать, которые включают летать генетики старения и вверх по течению от вскрытия и окрашивание или культивирование в течение 24 часов и введения препарата ниже по течению от вскрытия.

Рисунок 3 конфокальной проверки autophagosomes и лизосом в одном омматидия расчлененный от AW; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP.:: Atg8 / + летают, выражая полиглутаминовых Atrophin мутанта и в возрасте 12 дней при температуре 29 ° C. Панель светлого (вверху справа) показывает почти нетронутыми структуры омматидия и кадров указывает сканируемой области. Красный знаки Лизосомы, зеленый autophagosomes, авто-лизосом, в результате чего в результате слияния двух органелл, появляются желтые. Стрелки указывают на двух текущих событий слияние autophagosomes и лизосомы.

Одно рассечение омматидия представленные здесь коллекции позволяет более глубокой биологической ячейки информацию о процессах, как нейродегенеративные, когда моделируется в глазу дрозофилы. Фоторецепторных нейронов более доступной, чем в других нейронов и их цитоплазме особенно велик, и, таким образом подходящих для изучения динамики пузырька, в тот же клетки, используемые умело во многих моделях количественно нейродегенерации в естественных условиях. Важнейшим аспектом рассечение в основном способность выполнять его на нефиксированной ткани, которые никогда не должны подвергаться воздействию воздуха или пересыхают. Возможности для расширения этой базовой техники таковы (рис. 2), что он может, а революцию информацию, полученную от глаз модели нейродегенерации, что позволяет все виды манипуляций возможно в первичной культуре нейронов связаны с генетическими модификациями удивительные возможности в мух .

В сочетании с мозаичной техники, чрезвычайно полезны в нейродегенерации исследования ⁹ может позволить идентификации клеточных биологических изменений в определенное подмножество мутант омматидиев, в присутствии контроля веса с самого же летать.

Когда расчлененный омматидии хранятся в культуре, reponses к наркотикам, как рапамицин ¹⁰ или parquat ¹¹ могут быть лучше контролируется и количественно, чем при введении живой мухи. Основным ограничением система состоит из времени жизни расчлененный омматидиев в области культуры, которые мы не смогли расширить далеко за 24 часов.