Utvinning av hög molekylvikt DNA från Microbial Mats

1. Microbial Cell Extraktion:

1. Homogenisera mikrobiella mattor med en steril slipning stöt genom att blanda noggrant. Placera ungefär alla 30 g (våtvikt) av homogeniserade matta material i sterila behållare av Waring mixer, tillsätt ungefär 100 ml 1 M NaCl (eller en koncentration som är specifika för prov i bruk), och blandar tre gånger på medelhög hastighet under 1 minut med intermittent kylning i en -20 ° C frys i 1 min. Överför suspensionen i en 250 ml centrifug flaska och fylla de återstående tomma volymen med 1 M NaCl. Förbered NaCl lösning i autoklaveras DI vatten och filtrera sterilisera den.
2. Ytterligare rubba den mikrobiella celler från matrisen genom att skaka (150 rpm) med en vortexer (Vortex-Genie ^R 2) i rumstemperatur i 30 min.
3. Centrifugera vid låg hastighet (500x g) i 15 minuter vid 4 ° C. Försiktigt föra över supernatanten i en kolv med liten störning som möjligt sediment.
4. Med hjälp av pelleterat sedimentet, upprepa blandning och steg 1,2 och 1,3 ytterligare fyra gånger med tillägg av färska NaCl till varje sediment pellets i slutet av steg 1,3. Supernatanten från varje NaCl extraktion överförs till en ny kolv.
5. Kombinera supernatanterna från 5 cellen extraktioner och centrifugera i portioner om 200 ml i hög hastighet (25.000 xg) i 15 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen, resuspendera varje cell pelleten i 10 ml 2% natriumhexametafosfat, kombinera pellets och göra upp volymen till 200 ml med 2% natriumhexametafosfat. Tvätta cellerna genom att skaka (150 rpm) i rumstemperatur i 30 min. I slutet av detta steg bör du ha bara ett rör av celler att gå vidare till nästa steg.
6. Centrifugera i hög hastighet (25.000 xg) i 15 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen, resuspendera cellpelleten i 200 ml TE (50 mM EDTA) och tvätta cellerna genom att skaka (150 rpm) i rumstemperatur i 10 min.
7. Centrifugera i hög hastighet (25.000 xg) i 15 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten, återsuspendera i 15 ml TE (10 mM EDTA), och lagra 200-mikroliter alikvoter vid -80 ° C tills det behövs för DNA-extraktioner.

2. DNA-extraktion och rening:

1. Tillsätt 200 mikroliter 5 M NaCl, 200 mikroliter 10% SDS och 100 mikroliter 14,3 M β-merkaptoetanol till 200-mikroliter mikrobiell cell delmängd. Blanda försiktigt genom att vända 4-6 gånger.
2. Ämne blandningen till 3 rundor av frys-tö genom att sänka i flytande kväve i 2 min följt av upptining i ett 65 ° C vattenbad i 5 min. Utöka sista upptining till 10 min.
3. Tillsätt 200 mikroliter 5 M kaliumacetat (pH 5,5) och placera på is i 10 min. Centrifugera vid 10000 xg under 10 minuter vid 4 ° C och överför supernatanten till ett nytt rör med hjälp av ett brett bar pipettspetsen. Tillsätt 3 mikroliter av RNase A och inkubera vid 37 ° C i 1 timme.
4. Tillsätt lika volym kloroform, skaka om hastigt genom inversion och centrifugera vid 15.000 xgi 10 minuter vid rumstemperatur.
5. Försiktigt överföra det översta lagret av supernatanten i ett nytt rör med hjälp av ett brett bar pipettspetsen. Undvik att pipettera den vita gränssnittslager ligger mellan övre och nedre skikt. Upprepa kloroform-extraktionsförfarande.
6. Tillsätt en motsvarande volym av kyld (vid -20 ° C) isopropanol till supernatanten och inkubera på is i 30 min för att fälla DNA.
7. Centrifugera vid max hastighet (20.800 xg) i 10 min vid 4 ° C till pellets DNA.
8. Kasta bort vätskefasen och tvätta DNA-pellets med 1 ml kyld (vid -20 ° C) 70% etanol.
9. Centrifugera vid max hastighet (20.800 xg) i 10 min vid 4 ° C, kassera supernatanten, upprepa 70% etanol tvätta och lufttorka DNA pellets i 10 min. Upprepa 70% etanol tvätt.
10. Resuspendera DNA i 25 mikroliter TE (10 mM EDTA), varm vid 65 ° C i 5 min, kombinera till en tub om flera rör har använts, och make-up volymen till 500 mikroliter med TE.
11. Tillsätt 500 mikroliter iskall (eller vid 4 ° C) 20% polyetylenglykol (PEG) (upprättad i 1,2 M NaCl). Blanda försiktigt genom vändning, inkubera på is i 10 min, och centrifugera vid maximal hastighet i 10 min vid 4 ° C till pellets DNA. Avlägsna och kassera supernatanten och tvätta pelleterat DNA med 1 ml kyld 70% etanol, lufttorka i 10 min, och återsuspendera i 30-50 mikroliter TE eller molekylär kvalitet vatten. Underlätta resuspension av DNA genom uppvärmning vid 65 ° C i 5 min och Store DNA vid -80 ° C.

3. DNA-renhet, koncentration och storlek Fastställande:

1. Bestäm DNA-kvalitet genom att mäta A _260/280 och A _260/230 nyckeltal med hjälp av en Nanodrop 1000 spektrofotometer eller någon annan lämplig instrumentering.
2. Bestäm DNA-koncentration med hjälp Quant-IT dsDNA Assay kit enligt tillverkarens anvisningar.
3. Bestäm DNA-storlek med puls elektrofores fältet gel. Bered 1% agarosgel med 0,5 x TBE och använder följande parametrar på CHEF Mapper XA-systemet; inledande byta tid på 0,35 s, en sista switch tiden 7,67 s och 120 ° ingår vinkel för en lutning på 6,0 V / cm vid en linjär ramping faktor. Stain gel med 1 x SYBR Green I i 30 min. Belastningen mellan 700-1000 ng totala DNA på gelen. Se figur. 3 för en komprimerad form av det kompletta protokollet.

Representativa resultat:

Cell extraktion:

Sekventiell mikrobiell cell extrakt (supernatanterna) har visat att grumling av utdrag minskar då antalet extraktioner öka. Detta tyder på en minskning av antalet celler efter varje ny cell extraktion. Viktigt att notera här är att eftersom varje extra cell extraktionen ger möjlighet till förorening introduktion, bör antalet celler extraktioner minimeras så att den slutliga cellpelleten är representativt för den totala mikrobiella. Andra föroreningskällor kontrollerades genom att vidta tillräckliga laboratorium sterila tekniker. Till exempel var de som bereds på autoklaveras DI vatten och filtrera steriliseras. Behållare har steriliserats med alkohol, autoklaveras och behandlas under UV-ljus och ultraviolett crosslinker.

DNA-koncentration och kvalitet beslutsamhet:

Protokollet gav cirka 2 mikrogram HMW DNA (35-50 kb) (bild 4) per gram matta provet med en A _260/280 kvot på 1,6 och en A _260/230 förhållandet 0,7 (tabell 1). Även om en _260/230 förhållandet visade sig vara låg, ingen hämning av nedströms molekylär-baserade program som t.ex. PCR-amplifiering av 16S rRNA gener observerades i en separat studie ^7. Det är viktigt att notera att DNA från hypersaline Mats har två huvudsakliga källor till förorening, EPS och salter. Det är därför möjligt att spår av dessa föroreningar kan påverka en _260/230 nyckeltal trots enorma ansträngningar för att minska deras påverkan på nedströms applikationer.

DNA-bestämning av storlek:

Puls fältet gelelektrofores sysselsätter en pulserande ström med intermittent riktade switchar resulterar i en DNA cellprov som visas i figur 3. Vårt protokoll gav en HMW DNA på cirka 35-50 kb. Medan vissa DNA-storlek kan vara mindre än 30 kb, är det viktigt att ha en del av den smeta över 35 kb eftersom fosmid kloning kräver ~ 40 kb DNA-insatser och större DNA-fragment ger större tillgång till intakt biosyntetiska vägar. I våra studier var DNA smeta över 35 kb censurerade och renas för stora Sätt vektor kloning och andra molekylära applikationer.

Figur 1. Hypersaline mikrobiell matta provtagningsplatsen (Big Pond) som finns på Eleuthera, Bahamas.

Figur 2. Ett tvärsnitt av hypersaline mikrobiella mattan används i denna studie. Den mikrobiella mattan erhölls från en hypersaline damm ligger på Eleuthera, Bahamas.

Figur 3. Schematisk representation av förfaranden som ingår i mikrobiell cell utvinning, cellslys, extraktion och rening av metagenomic DNA. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Molekylvikt karakterisering av extraherat DNA med puls elektrofores fältet gel. Körfält M är en HMW markör, och gränder 1 och 2 replikat av metagenomic DNA extraherat från Eleuthera hypersaline mattan med hjälp av ovanstående protokoll.

Tabell 1. Mätning av koncentration och kvalitet av DNA extraherat från mikrobiell hypersaline matta.

Med tanke på att de totala celler avlägsnas från komplexa och mycket olikartade prover mikrobiell matta inte är praktiskt, är det främsta problemet hur väl de extraherade cellerna representerar gemenskapens övergripande mikrobiell matta. I en tidigare studie visade PCR-DGGE analys av mikrobiella 16S rRNA gener som de fem cellen tas bort stegen används i detta protokoll extrakt celler som är representativa för den totala mikrobiella mattan samhället ^7. Det faktiska antalet celler utvinning steg som krävs för att ge en cellpellet som är representativ för den totala mikrobiella sannolikt kommer att förändras beroende på provtyp. För optimal protokoll utveckling för olika prover, är en småskalig pilotstudie rekommenderas där empiriska tester av det återvunna mikrobiella rikedomen efter varje cell extraktionen jämförs med rikedomen i den ursprungliga gemenskapen.

Fosmid kloning kräver HWM DNA 35-40 kb för klon att konstruera biblioteket ^8. Vår protokoll gav DNA med storlekar från 35 till 50 kb (bild 4) och har framgångsrikt använts för att generera en fosmid-baserat metagenomic biblioteket (opublicerade resultat). Andra protokoll som används för DNA-extraktion från EPS-producerande marina bakterier gav ~ 23 kb ^4. I funktionella metagenomic studier, stora DNA-fragment ger större tillgång till ett brett utbud av gener som kodar för biosyntetiska vägar samt för funktionella beteenden ^9,10. Således är HMW DNA en viktig förutsättning för metagenomic studier. Generera stora Sätt metagenomic bibliotek från miljöprover kommer att öka chanserna att upptäcka vägar roman biosyntetiska som kan leda till upptäckten av nya gener. Detta protokoll kan användas för att extrahera DNA från andra eldfasta miljöprover.