Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

Wu, D., Yotnda, P. Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture. J. Vis. Exp. (54), e2899, doi:10.3791/2899 (2011).

Hipóxia é definida como a redução ou falta de oxigênio nos órgãos, tecidos ou células. Esta diminuição da tensão de oxigênio pode ser devido a uma oferta reduzida de oxigênio (causas incluem rede de vasos sanguíneos insuficientes, defeito dos vasos sangüíneos e anemia) ou a um aumento do consumo de oxigênio relativo ao fornecimento (causada por uma maior taxa de proliferação celular súbita) . Hipóxia pode ser fisiológica ou patológica como em tumores sólidos ^1-3 reumatóide etc artrite, aterosclerose, ... Cada tecidos e células têm uma capacidade diferente para se adaptar a esta nova condição. Durante a hipóxia, hipóxia induzida fator alfa (HIF) é estabilizado e regula vários genes como aqueles envolvidos na angiogênese ou transporte de oxigênio ^4. A estabilização desta proteína é a marca registrada de hipóxia, portanto, a detecção de HIF é rotineiramente usado para triagem de ^07/05 hipóxia.

Neste artigo, propomos dois métodos simples para induzir hipóxia em culturas de células de mamíferos e testes simples para avaliar o estado hipóxico dessas células.

1. Hipóxia induzida por solução de ₂ CoCl

Cloreto de cobalto hexa-hidratado (II) (CoCl ₂ • 6H ₂ O, MW = 237,9) é um indutor químico da hipóxia induzida por fator de 1,3 ^8. Este produto é solúvel em água (100 mg / ml), produzindo uma solução clara e vermelho.

1. Prepare uma solução estoque 25 mM em água dd estéril, (preparar imediatamente antes do uso)
2. Use CoCl ₂ na concentração final de 100μM em seus meios de cultura de células regulares para induzir hipóxia.
3. Adicione o CoCl ₂ mídia contendo as suas células e incubar as culturas de 24 horas em uma incubadora convencional (37 ° C, 5% C0 _2).

A concentração acima funciona para as linhas de células que temos testado, mas cada linha celular deve ser testado em várias concentrações (para estabelecer uma curva dose-dependente), bem como em vários tempos de incubação, a fim de limitar a toxicidade relacionada com a droga e otimizar o ensaio.

2. Hipóxia induzida em Modular Incubadora Câmara

1. Preparar pelo menos duas culturas de células idênticas (cultura twin). Culturas de células pode ser em barris, pratos ou travessas cultura. Para abrir a câmara, abre pela primeira vez as duas braçadeiras de plástico branco localizado na tubos ligados à câmara (tubos utilizados para a injeção / purga do gás hipóxico) e abra cuidadosamente o grampo anel de aço.
2. Solte o grampo. A tampa e bandejas podem agora ser removido.
3. Coloque a cultura de células na câmara hipóxica. Também colocar uma placa de Petri contendo água estéril na câmara para fornecer umidificação adequada das culturas.
4. Coloque a cultura de células "gêmeo" em normóxia como controle.
5. Verifique se o seu bandejas são garantidos e não em movimento, e depois fechar a câmara com a tampa. Posicionar corretamente a braçadeira anel de aço para garantir o fechamento hermético da câmara e fechá-lo.
6. Para criar hipóxia, conectar o tubo a um "tanque de hipóxia", contendo a 1% da mistura de gases O _2. Se você tiver um medidor de fluxo conectado ao seu tanque de sua câmara estará diretamente conectado a ele (gás tanque de fluxo metros-câmara). Usamos um medidor de fluxo incorporadas em nosso regulador.
7. É importante remover a maior parte se não estiver presente todo o oxigênio na câmara e em seus meios, para fazê-lo lavar a câmara através da abertura do tanque de gás a uma vazão de 20 litros por minuto por 7-10 minutos, em seguida, desligar rapidamente o fluxo de gás e fechar completamente a câmara, fechando ambos os grampos branco.
8. Retorno da câmara para uma incubadora convencional para o período de tempo desejado. Se você usar grandes culturas, permitem mídia em culturas de-gás para 1-2 horas e depois repetir flush.
   As etapas acima são baseados nas recomendações do construtor "(Billups-Rothenberg, Inc). Certifique-se de tanque de gás são devidamente protegidas em todos os tempos.

Notas:

• , A fim de eliminar o O ₂ contidas na mídia, é aconselhável a re-gás na câmara de uma vez depois de 1-3 horas.
• Por tempo de incubação mais longo do que 48 horas também é aconselhado a re-câmara do gás.
• Sensores de oxigênio (eletrodos / manômetro) que permitem medições do O ₂ contidos em células / câmara irá proporcionar uma medição mais precisa do O intracelular / câmara de ₂ contêm).
• A cultura de células em intervalos de tempo diferentes para fazer uma curva de tempo-seria ajudar a determinar a expressão de tempo ideal de HIF-1α em suas células particular.

3. Avaliação de hipóxia

1. HIF-1 de detecção de α por western blot.
   1. Reabrir a sua câmara como descrito na seção 2.2 e colocar imediatamente suas culturas no gelo.
   2. Lyse hipóxia células tratadas e não-tratados com 5% de solução SDS nas placas, em seguida, transferir o lyzate célula para tubos, sonicate, spindown os restos celulares e recolher o sobrenadante.
   3. Concentração medida de proteína usando kit BCA, prepare amostra pela adição de tampão de carregamento e aquecimento a 95 ° C por 5 min.
   4. Electroforese de proteínas em um gel SDS 8% de poliacrilamida e transferência para membranas de nitrocelulose.
   5. Bloquear a membrana em PBS contendo 5% de leite sem gordura seco e 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite em shaker.
   6. Immunoblot durante a noite com anti-HIF-1α anticorpo primário monoclonal (1 / 600) no mesmo tampão a 4 ° C.
   7. Lavar 3 vezes em PBS contendo 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente, 5min de cada vez e incube com HRP-anticorpo secundário (1 / 2000) em PBS + 0,1% Tween 20 por 45 min.
   8. Lavar 3 vezes em PBS contendo 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente, 5min / hora.
   9. Use Pierce kit ECL e X-ray filme para mostrar a banda de proteína
2. Elemento Responsive hipóxia (HRE).
   HIF-1α regula numerosos genes (ou seja, VEGF, EPO) por ligação a uma seqüência chamada elemento regulador hipóxia (HRE). Usando HRE associado a um gene marcador it é possível detectar atividade de HIF ^9. Para utilizar este método, primeiro você precisa transfectar suas células com um plasmídeo HRE-luciferase usando um método de transfecção adaptado às suas células. Por exemplo usamos Lipofectamine 2000. Células precisam ser transfectadas pelo menos 4 horas antes de ser incubadas em hipóxia e normóxia. Desta vez, permite que o DNA para entrar nas células, para que este primeiro passo não é afetada pela hipóxia. O sinal de luciferase é detectada através de um kit de ensaio de luciferase.
   1. Incubar a sua HRE-transfectadas células em hipóxia na câmara modular ou usar HRE-transfectadas células incubadas com CoCl _2, incluem um controle normóxia.
   2. Após o período de incubação desejado, remova o meio de crescimento das células.
   3. Enxágüe células em PBS, remova o PBS.
   4. Dispense 400μl do reagente de lise 1X em placa de cultura e raspar as células em anexo, depois transferi-los para um tubo de micro.
   5. Pellet detritos por centrifugação breve.
   6. 20μl mistura de células lisados ​​sobrenadante com 100μl de reagente de ensaio de luciferase e medir a luminescência com um luminômetro.

4. Resultados representativos:

Em células K562 (linha de células humanas de leucemia) cultivados dois dias em baixa de oxigênio, comparado à normóxia, hipóxia induz um aumento do HIF-1α proteína que foi detectada por western blot (Figura 1).

Usando HRE-luciferase modificado 293 células (linhagem de células embrionárias de rins) cultivados em hipóxia, um aumento significativo de HIF-1α atividade foi detectada em células hipóxicas (Figura 2).

Figura 1: Aumente o HIF-1α em células hipóxicas. K562 células foram cultura em normóxia e hipóxia (câmara hipóxica) por 48 horas e analisadas por western blot usando um anticorpo específico para o HIF-1α. Um anticorpo específico para actina foi usado para o controle de carga.

Figura 2: HIF-1α atividade. HRE-luciferase modificado 293 células foram cultivadas em hipóxia e normóxia durante 48 horas e, em seguida, lisados ​​para detectar o sinal luciferase usando um kit de ensaio de luciferase e um luminómetro. Os resultados são expressos como a unidade de luminescência relativa (RLU).

Proliferação celular e viabilidade em condições de hipóxia variar muito, dependendo dos tipos de células. Portanto, você deve ajustar o número de células ou o número de culturas placas você começa com a certeza que terá número suficiente de células / proteínas para suas experiências.

O método de cloreto de cobalto tem a vantagem de ser barato e rápido. Este produto imita hipóxia induzindo HIF-1/3α mas pode também regulam outros genes, certifique-se este produto está adaptado ao seu projeto, verificando o que outros efeitos pode ter sobre a função e fenótipo de suas células em particular, independentemente da "imitam- efeito "hipóxia. Outro medicamento também usado para imitar a hipóxia é o mesilato de desferroxamina (DFO, utilizado numa concentração de 100 mM final). O uso dessas drogas permite que o experimentador para abrir a placa de cultura / prato / frasco muitas vezes sem afetar a "condição de hipóxia".

O nível de oxigênio contido na mistura de gás pode variar de acordo com suas experiências e tipos de células como os valores variam de acordo com hipóxia dos tecidos e tipos celulares. De fato, algumas células são hipóxica em 5% O ₂ outros precisam menos de 1% O ₂ a ser hipóxica. 5% de CO ₂ é adicionado à mistura de gás para estabilizar o pH das culturas, o resto do gás é geralmente nitrogênio.

Câmaras hipóxicas têm a vantagem de não usar drogas que pode alternar o comportamento das células, independentemente da tensão de oxigênio. No entanto, nem todos os tipos de experimentação pode ser feito como o oxigênio re-entra na câmara em cada abertura e, assim, diminui a hipóxia. Você deve considerar este fator em seus experimentos; hipóxia / reoxigenação é uma condição específica que podem afetar alguns tipos de células. Uma alternativa é a utilização de estações de trabalho hipóxia (ligado a tanques de pré-mistura de gás ou de sistemas de gás de mistura) ou maior incubadora hipóxia (câmara de processamento de hipóxia com porta-luvas), que permite a experimentação de mudar de mídia e manipular as células em ambiente hipóxico contínua. Várias câmaras hipóxicas foram comercializados nos últimos dez anos e deve ser escolhido de acordo com o seu laboratório utilizado, projetos, espaço, tamanho, orçamento e. Sempre garantir o bom uso e condição da sua câmara para garantir condições de cultivo correto. Em geral quando se usa uma câmara, o nível de hipóxia pode ser modulada, selecionando as misturas de gases diversos (ou seja, 1%, 5% a 10% de oxigênio).

Em relação à detecção de HIF-1α, é importante saber que algumas linhas de células cancerígenas HIF-1α expressar em normóxia. Portanto, é fundamental usar um normoxia-controle para determinar o nível basal de HIF nestas linhas celulares. HIF-1α também pode estar presente em normóxia não-malignas em células após estimulação celular ou stress. Isso também poderia ocorrer se essas células estão famintos, certifique-se culturas de células são o alimentar adequadamente e mantido.

Não há conflitos de interesse declarados.

1. Swinson, D.E. & O'Byrne, K.J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7 (4), 250-256 (2006).
2. van Laarhoven, H.W., et al. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64 (2), 473-482 (2006).
3. Hockel, M., et al. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26 (1), 45-50 (1993).
4. Semenza, G.L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14 (16), 1983-1991 (2000).
5. Semenza, G.L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 588-594 (1998).
6. Tatum, J.L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
7. Brahimi-Horn, M.C. & Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122 (Pt 8), 1055-1057 (2009).
8. Piret, J.P., Mottet, D., Raes, M., & Michiels, C. CoCl₂, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
9. Emerling, B.M., Weinberg, F., Liu, J.L., Mak, T.W., & Chandel, N.S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2622-2627 (2008).

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