Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2900, doi:10.3791/2900 (2011).

Microiontophoresis betekent doorgang van stroom door een micropipet tip om een ​​opgeloste stof te leveren op een aangewezen locatie binnen een experimentele voorbereiding. Microiontophoresis kan simuleren synaptische transmissie ^een door het leveren van neurotransmitters en neuropeptiden op neuronen reproduceerbaar ^2. Verwaarloosbare volume (vloeistof) verplaatsing vermijdt mechanische verstoring van de experimentele voorbereiding. Aanpassing van deze technieken om de microcirculatie ³ heeft het mogelijk gemaakt mechanismen van vasodilatatie en vasoconstrictie te bestuderen op microscopisch niveau in vivo ^4,5. Een belangrijk voordeel van een dergelijke gelokaliseerde levering is mogelijk vasomotorische reacties te bestuderen op bepaalde plaatsen binnen een netwerk zonder microvasculaire roepen systemische of reflexieve veranderingen in de bloeddruk en weefsel doorbloeding, waardoor onthullen de intrinsieke eigenschappen van haarvaten.

Een beperking van microiontophoresis is dat de precieze concentratie van het middel geleverd aan de plaats van belang is moeilijk vast te stellen ^6. Toch, de release van de micropipet tip is evenredig met de intensiteit en de duur van de huidige ^2,7 uitwerpen, zodanig dat reproduceerbaar stimulus-respons relaties eenvoudig worden bepaald onder gedefinieerde experimentele omstandigheden (zie hieronder). Bijkomende factoren die van invloed microiontophoretic aflevering onder meer opgeloste concentratie en de ionisatie in oplossing. De inwendige diameter van de micropipet tip moet worden ~ 1 micrometer of minder tot diffusie 'lekken', die kan worden tegengegaan met een behoud van de huidige minimaliseren. Zo een naar buiten (positieve) stroom wordt gebruikt om een ​​kation en een negatieve stroom wordt gebruikt om het te behouden binnen de micropipet uit te werpen.

Fabricage van micropipetten wordt vergemakkelijkt met geavanceerde elektronische trekkers ^8. Micropipetten worden getrokken uit glazen capillaire buisjes met daarin een gloeidraad die 'wieken' oplossing in de punt van de micropipet toen gevuld vanuit de back-end ("opgevuld"). Dit wordt gedaan door het invoegen van een microcapillaire buis verbonden met een spuit met de oplossing van de rente en het uitwerpen van de oplossing in het lumen van de micropipet. Micromanipulators in staat stellen de gewenste plaatsing van micropipetten binnen de experimentele voorbereiding. Micromanipulators gemonteerd op een beweegbare bodem kan worden gepositioneerd rond het preparaat volgens de topografie van microvasculaire netwerken (hieronder uitgewerkt).

Het huidige protocol toont microiontophoresis van acetylcholine (ACh ⁺ Cl ^-) op een arteriole van de muis cremaster spier voorbereiding (zie bijbehorende protocol: Jove ID # 2874) aan endotheel-afhankelijke vasodilatatie te produceren. Stimulus levering is gesynchroniseerd met gedigitaliseerde beeld acquisitie met behulp van een elektronische trigger. Het gebruik van Cx40 ^BAC-GCaMP2 transgene muizen ⁹ maakt visualisatie van intracellulaire calcium reacties onderliggende vasodilatatie in arteriolaire endotheelcellen in de woonkamer microcirculatie.

1. Dierverzorging en gebruik

Na de beoordeling en goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite, worden mannelijke muizen ten minste 12 weken oud gebruikt. Een muis is verdoofd met pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) injectie. Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen, wordt verdoving onderhouden door supplementen (10-20% van de eerste injectie, ip) als nodig is (elke 30-60 minuten, aangeduid met terugtrekking reactie op teen of staart knijpen). Na voltooiing van de experimentele procedure de muis is een overdosis aan pentobarbital (ip) en gedood door cervicale dislocatie.

2. Micropipetten en Microiontophoresis

1. Microiontophoresis micropipetten (interne tip diameter, ~ 1 micrometer) worden bereid uit borosilicaatglas capillaire buizen met behulp van een horizontale pipet trekker. Wij kiezen voor een ~ 5 mm conus voor stijfheid; langere versmalt zijn flexibeler.
2. Micropipetten zijn opgevuld met 1M ACh (Figure1A-C) opgelost in 18,2 MΩ water. Voor opvullen, is een microcapillaire buis is aangesloten op 0,2 um filter gekoppeld aan een spuit met de agonist van belang (Figuur 1). Deze kunnen gemakkelijk worden vervaardigd (zie hieronder) of gekocht bij commerciële leveranciers. De microcapillaire buis wordt ingebracht in de achterkant van de micropipet en ACh oplossing wordt geleverd in het lumen, terwijl het intrekken van de microcapillaire buis als de micropipet vult. Houd de micropipet met de punt naar beneden, zijn luchtbellen verwijderd worden door voorzichtig flicking de micropipet.
3. De micropipet is vastgezet in een houder gemonteerd in een micromanipulator (figuur 2). De houder heeft een zilveren draad aansluiten van de ACh oplossing binnen de micropipet aan een externe pin, die op zijn beurt verbonden is met de positieve pool van een microiontophoresis programmeur. Een tweede zilveren draad vastgezet aan de rand van het weefsel voorbereiding is aangesloten op de negatieve pool om het circuit te voltooien als het topje van de micropipet is gevorderd in de fysiologische zoutoplossing over de voorbereiding.
4. Een behoud van de huidige wordt toegepast op vasodilatatie voorkomen (of TL-respons) wanneer de micropipet tip is gepositioneerd naast de arteriolaire muur. Behoud van de huidige zal variëren met de grootte van de micropipet tip (inwendige diameter = 1 micrometer) en agonist concentratie, maar is zeer reproduceerbare voor bepaalde parameters (we gebruiken ~ 200 nA voor 1M ACh, een urn tip). Het behoud van de huidige houdt samenvalt met de levering van de huidige uitwerpen via het elektronische trigger (aanvullende figuur 1) gesynchroniseerd met het begin van het beeld acquisitie.

3. Micromanipulatie

1. Een aangepaste platform voor een XY-microscoop stadium werd vervaardigd uit ferromagnetische roestvrij staal. Platform afmetingen (1 / 8 "X 12" X 13 ") in staat stellen voldoende ruimte om positie micromanipulators rond de experimentele voorbereiding naar wens (figuur 2A). Micromanipulators bevestigd aan magnetische voeten (Figuur 2B) in staat stellen positionering als gedicteerd door de bereiding. Dit zijn direct geplaatst op de gefabriceerde platform rond de voorbereiding voor het positioneren micropipetten op plaatsen van belang (figuur 2C).

4. Representatieve resultaten

1. Met de micropipet tip gepositioneerd naast een arteriole, is er fluorescentie respons op ACh (behoud van de huidige dan aangepast aan ACh lekkage te voorkomen). Onder een drempel stimulans was er geen effect. Echter, als stimulans intensiteit toenam, endotheliale cellen calcium fluorescentie toegenomen steeds grotere afstanden langs de arteriole, net als de intensiteit van de fluorescentie op de plaats van stimulatie (figuur 3).

Figuur 1. Methode voor Opvullen Microiontophoresis pipetten. A) Een microcapillaire buis (groene pijl) is vastgezet in een knelkoppeling (blauwe pijl) bevestigd aan een 0,2 um filter (paarse pijl), die vervolgens is bevestigd aan een injectiespuit gevuld met 1M ACh. B) De microcapillaire buis wordt ingevoerd in de microiontophoresis pipet via de back-end en de oplossing is verplaatst naar het lumen van de micropipet. C invullen) Als de pipet gevuld is, de punt naar beneden te houden en voorzichtig flick boven de taper te bellen (zwarte pijl) te verwijderen.

Figuur 2. Op maat Platform voor micromanipulator Placement. .. A) een ferromagnetisch roestvrij stalen platform werd geplaatst op een aangepaste MVX10 microscoop databank met een XY-translationele fase B) Circulaire magnetische voeten aan de onderkant van de compacte 3-assige micromanipulators C) Micromanipulators gepositioneerd rond de experimentele opstelling (Zie begeleidend protocol: Jove ID # 2874) aan specifieke sites van belang te bestuderen. Deir compacte afmetingen en de veelzijdigheid kunnen meerdere micropipetten gelijktijdig gebruikt worden.

Figuur 3. Calcium Fluorescentie in arteriolen. Calcium fluorescentie van de endotheliale cellen aan de binnenkant van de muur arteriolaire verhoogd met stimulus intensiteit. De eerste drie panelen beelden te zien van de fluorescentie reacties op A) 250 nA, B) 500 nA en C) 1000 nA uitwerpen van de huidige (alle 500 ms pulsduur). De afstand waarover endotheelcellen calcium fluorescentie verhoogd wordt aangegeven door haakjes in AC (~ 130, 270 en 400 um, respectievelijk). De referentie-lijn over de arteriole in elk paneel geeft aan waar fluorescentie reacties (F / Fo) om ACh werden opgenomen op de plaats van stimulatie. D) Opnamen van F / Fo versus tijd voor het verhogen van ACh stimuli. Als uitwerpen huidige toegenomen, F / Fo toegenomen in amplitude en duur. Merk op dat 100 nA stimulus was onder de drempel en had geen effect.

Aanvullende Figuur 1. Schakelschema voor elektronische trigger. Deze schakeling is gekoppeld met een parallelle poort van een personal computer. Wanneer geactiveerd zal het een constante TTL puls van 5V biedt. De 7805 chip is een 5V spanningsregelaar aangesloten op een 9-12V DC voeding (een accu van de juiste voltage is prima). Uitvoer van de 7805 levert stroom aan de Quad Bilaterale Switch en de uitgang van het circuit. Input over de 1K weerstand is van de computer.

Het protocol hier beschreven toont werkwijzen voor het bereiden en implementeren van Micropipetten microiontophoresis. De levering van acetylcholine wordt gebruikt om calcium signalering ten grondslag liggen aan endotheel-afhankelijke vasodilatatie illustreren in arteriolen van de verdoofde muis. Onze resultaten illustreren dat de afstand waarover ACh endotheelcellen calcium fluorescentie neemt toe met de intensiteit van het uitwerpen stroom van de microiontophoresis micropipet (figuur 3). Het ontbreken van fluorescentie te verhogen onder rusttoestand geeft te verwaarlozen lekkage van ACh uit de micropipet. Het gebrek aan respons op 100 nA stimulus intensiteit (figuur 3, legenda) laat zien dat een drempel intensiteit van de stimulatie is nodig voor endotheliale cellen calcium te verhogen. Deze technieken kunnen eenvoudig worden aangepast aan andere vasoactieve stoffen en weefsel preparaten.

Praktische overwegingen: In het werken met microiontophoresis tot arteriolen reactiviteit studie, een aantal dingen moeten worden erkend. Hoewel het moeilijk gebleken om de werkelijke concentratie van de geleverde agonist te bepalen, stimulus-respons curves zijn reproduceerbaar binnen en tussen de voorbereidingen. Deze kunnen worden uitgevoerd door houden pulsduur constante (bijvoorbeeld 500 ms) en het variëren van de ejectie stroom (bijvoorbeeld, 250, 500 en 1000 nA; Figuur 3). Als alternatief kan uitwerpen stroom worden constant gehouden (bijvoorbeeld 500 nA) en pulsduur gevarieerd (bijvoorbeeld, 250, 500 en 1000 ms). Voor een verwijzing naar de acties van een bepaalde concentratie agonist, kan de bereiding worden superfused met de juiste oplossing ^5. Omdat de drijvende kracht voor opgeloste stof uitworp is elektrische lading beweging, moet de agent te leveren dragen een netto lading worden verplaatst van de micropipet. Om ervoor te zorgen dat de agent van belang is de primaire ladingdrager, is het opgelost bij hoge concentratie (bijvoorbeeld een M voor ACh) tot electro-osmose te minimaliseren. Wanneer dit vereist het manipuleren van de pH van de micropipet vulling oplossing, zijn voertuig controles verplicht om niet-specifieke effecten vast te stellen. Passende controles moeten ook worden uitgevoerd voor de doorgang van de stroom alleen (bijvoorbeeld met behulp van micropipetten gevuld met isotone zoutoplossing). De effectieve afstand voor verspreiding van de agent van zijn plaats van lozing dient te worden vastgesteld en is het gemakkelijkst empirisch bepaald door het verdwijnen van een fysiologische respons (bijvoorbeeld, vasodilatatie of een stijging in de intracellulaire calcium na het uitwerpen van ACh) als de micropipet is gepositioneerd op gedefinieerde afstand van het doel site. In de praktijk is de effectieve diffusie afstand sterk beïnvloed door de manier waarop de top van de micropipet is gepositioneerd in het weefsel, bijvoorbeeld als het puntje ingedrukt in het weefsel en de tip is afgesloten, dan uitwerpen verminderd is. Overmatige bindweefsel is bijzonder lastig en moeten worden verwijderd uit het weefsel oppervlak tijdens chirurgische voorbereiding. Er moet ook aandacht worden besteed aan de mogelijkheid van uitputting van de punt van de aangewezen agent. Dit wordt geminimaliseerd door gebruik te maken relatief korte pulsen (bijv. ≤ 1 s). Met aanhoudende stromen (bijvoorbeeld enkele seconden), kan de agonist worden verdreven uit het puntje sneller dan het kan worden vervangen door diffusie vanuit de bulk invullen oplossing in de micropipet.

Omdat verwaarloosbaar volume wordt verplaatst met microiontophoresis, als men probeert om de lokale ionische milieu te veranderen (bijvoorbeeld om een depolariserende K te leveren ⁺ stimulus), kan dit niet effectief worden bereikt met microiontophoresis, maar is gemakkelijk bereikt met de druk uitwerpen van bulk vloeistof met de gewenste samenstelling. Voor lokale stimulatie van een arteriole, micropipet tips met een binnendiameter van 2-3 um werken goed met schietstoelsystemen Pressure 4-5 psi (28-35 kPa) en de pulsduur (bijv. 1 seconde) bediend met een magneetventiel ^10. Waar duurzame levering van een agent van een micropipet op een microvessel nodig is, wordt de druk uitworp bij voorkeur met behulp van micropipetten van adequate interne tip diameter (bijvoorbeeld ~ 10 urn) ^11,12. Een hydrostatische kolom met een bekende hoogte met een kraan klep zorgt voor een goedkope, goed gedefinieerde on / off constante druk hoofd. Debieten worden bepaald door de binnendiameter van de pipetpunt en de rij-druk. Zoals altijd, het voertuig controles zijn essentieel voor niet-specifieke acties van de druk uitwerpen uit te sluiten.

Alle procedures en protocollen betreffende dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Missouri en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en gebruik van proefdieren. Productie van dit artikel werd gesponsord door Stanford Photonics.

Onderzoek in de auteurs 'laboratorium wordt ondersteund door de National Institutes of Health beurzen R37-HL041026, R01-R01-HL086483 en HL056786 (SSS) en door F32-HL097463 en T32-AR048523 (PB) van de Verenigde Staten Public Health Service.

1. Majno, G., & Palade, G.E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
2. Majno, G., Palade, G.E. & Schoefl, G.I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
3. Grant, R.T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
4. Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
5. Bohlen, H.G., Gore, R.W., & Hutchins, P.M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13,125-130 (1977).
6. Klitzman, B., & Duling, B.R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, H481-490 (1979).
7. Hungerford, J.E., Sessa, W.C., & Segal, S.S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB  J. 14, 197-207 (2000).
8. Figueroa, X.F., Paul, D.L., Simon, A.M., Goodenough, D.A., Day, K.H., Damon, D.N., & Duling, B.R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
9. Wolfle, S.E., Schmidt, V.J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., & de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
10. Milkau, M., Kohler, R., & de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
11. Bagher, P., Duan, D., & Segal, S.S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol.110, 601-610 (2011).
12. Tallini, Y.N., Brekke, J.F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S.M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S.S., &  Kotlikoff, M.I. Propagated endothelial Ca²⁺ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40^BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
13. Grant, R.T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
14. Proctor, K.G., & Busija, D.W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249: H34-41 (1985).
15. Bagher, P., & Segal, S.S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. doi: 10.1111/j.1748-1716.2010.02244.x (2011).
16. Hill, M.A., Simpson, B.E., & Meininger, G.A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.