Morris Maze prova d'acqua per deficit di apprendimento e memoria in topi modello della malattia di Alzheimer

Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer's Disease Model Mice. J. Vis. Exp. (53), e2920, doi:10.3791/2920 (2011).

La Morris water maze (MWM) è stata istituita dal neuroscienziato Richard G. Morris nel 1981 al fine di testare l'apprendimento ippocampo-dipendente, inclusa l'acquisizione di dati spaziali memoryand memoria a lungo termine spaziale ^1. Il MWM è una procedura relativamente semplice costituiti in genere da sei prove al giorno, il vantaggio principale è la differenziazione tra i spaziale (nascosto-piattaforma) e non-spaziale (visibile piattaforma) le condizioni ^2-4. Inoltre, l'ambiente di test MWM riduce le interferenze pista odore ^5. Ciò ha portato il compito di essere ampiamente utilizzato nello studio della neurobiologia e neurofarmacologia di apprendimento e la memoria spaziale. Il MWM svolge un ruolo importante nella validazione di modelli di roditori per i disturbi neurocognitivi come la malattia di Alzheimer ^{6, 7.} In questo protocollo abbiamo discusso la procedura tipica di MWM per l'apprendimento e la memoria di test e analisi dati comunemente utilizzati nella malattia di Alzheimer nei topi modello transgenico.

1. Preparazione

1. Attrezzature di preparazione
   1. Ottenere una vasca circolare con un diametro di 150 centimetri e una profondità di 50 cm (Fig. 1). Se si utilizzano topi neri, una piscina bianco deve essere utilizzata, se si utilizzano topi bianchi, uno stagno nero dovrebbe essere usato.
   2. Disporre la stanza in modo tale che l'animale in fase di test non può vedere il sperimentatore durante il test. Questo può essere realizzato con tende o divisori.
   3. Luogo spunti alto contrasto spaziale per la stanza, e / o l'interno della piscina in un luogo che sarebbe al di sopra della superficie dell'acqua.
   4. Inserire una piattaforma di 10cm di diametro in piscina - bianco per una piscina bianca, plexiglass trasparente per una piscina nera. Riempire la piscina con acqua fino a quando la piattaforma è di 1 cm al di sopra della superficie dell'acqua. Lasciate che l'acqua a temperatura ambiente (22 ° C). A seconda della temperatura dell'acqua potrebbero essere necessari 1-3 giorni, o in alternativa l'acqua calda possono essere aggiunti per accelerare il raggiungimento dell'equilibrio.
2. Software per la preparazione
   1. Calibrare la piscina nel software di computer in modo la macchina fotografica in grado di creare informazioni fisiche distanza dal pixel-based informazioni. Dividere la piscina in 4 quadranti. Specificare la zona di piattaforma come zona variabile che può cambiare ad ogni prova. Creare 5 sottozone piattaforma - uno in ogni quadrante, e una al centro della piscina. Salvare la calibrazione e usarlo per i giorni di test rimanenti. (Vedi Fig. esempio. 2).
   2. Impostare il tempo massimo di prova di 60 sec. Se il mouse si trova la piattaforma prima di questo momento, programmare il software per fermare il processo quando la piattaforma è stata trovata.
   3. Specificare il programma per iniziare a tracciare automaticamente, quando lo sperimentatore esce dall'area di prova. Utilizzare qualsiasi "riflessione minimizzazione" delle opzioni del pacchetto software fornisce.
   4. Traccia lunghezza del percorso, la latenza di fuga, e il tempo trascorso in ogni quadrante.

2. Giorno 1: Piattaforma visibile

1. Programma del computer
   1. Caricare la calibrazione piscina nel software di monitoraggio.
   2. Creare 5 prove, con un inter-trial intervallo appropriato per l'esperimento. Programma la posizione della piattaforma e la direzione iniziando a variare con ogni prova. Vedi Tabella 1 per un protocollo di esempio.
2. Procedura di prova
   1. Trasferire i topi dalle loro struttura alloggiativa nella stanza comportamento. Tenere il mouse in una zona dove non riescono a vedere la piscina o indizi spaziali. Lasciate che adattarsi al nuovo ambiente per almeno 30 minuti prima del test.
   2. Mettere una bandiera sulla piattaforma per aumentare la sua visibilità.
   3. Per iniziare il test, sollevare il mouse dalla gabbia casa dalla base della coda. Sostenere il mouse come lo si porta alla zona test. Sollevare il mouse alla base della coda, leggermente posizionare il mouse in acqua, di fronte al bordo della piscina. Presto lasciare l'area test.
   4. Se il mouse si trova la piattaforma prima del 60 sec cut-off, permettere al topo di rimanere sulla piattaforma per 5 secondi poi tornare a casa sua gabbia. Se il mouse non trova la piattaforma, posizionare il mouse sulla piattaforma e permettono di rimanere lì per 20 secondi prima di tornare alla sua gabbia casa.
   5. Ripetere l'operazione per tutti i mouse della pista. Iniziare ogni prova successiva con una posizione diversa piattaforma e la direzione di partenza, come avete programmato sul software.
   6. Quando il test è completo, restituire i topi alla loro struttura alloggiativa. I topi sono asciugati e normotermia è assicurata prima di tornare a stabulario.
   7. In preparazione per il giorno seguente, togliere la bandiera dalla piattaforma e aggiungere altra acqua alla piscina di immergere la piattaforma a 1 cm sotto la superficie.

3. Giorni 2-5: Piattaforma Nascosto

1. Programma del computer
   1. Caricare la calibrazione piscina nel software di monitoraggio.
   2. Creare 5 prove, con un inter-trial intervallo appropriato per l'esperimento. Programma la posizione della piattaforma di rimanere nella stessa posizione in tutte le prove e giorni, ma hanno la direzione iniziale si differenziano ogni prova, ogni giorno.
2. Procedura di prova
   1. Per i topi neri, aggiungere non tossico, bianco, vernice in polvere tempera alla piscina e mescolare accuratamente. Uso abbastanza vernice in modo che la piattaforma sommersa non è visibile dalla superficie dell'acqua. Per i topi bianchi, una piscina nera con acque limpide e una piattaforma di plexiglas trasparente dovrebbe essere usato.
   2. Seguire i punti da 2.2.3 a 2.2.6.

4. Giorno 6: Sonda di prova

1. Programma del computer
   1. Caricare la calibrazione piscina nel software di monitoraggio.
   2. Creare 1 prova con nessuna zona della piattaforma, e una direzione di partenza. La direzione di partenza più lontano dal quadrante piattaforma utilizzata per 2-5 giorni è preferibile. Impostare la lunghezza sentiero per 60 sec.
2. Procedura di prova
   1. Rimuovere la piattaforma dalla piscina.
   2. Seguire i punti da 2.2.3 a 2.2.6.

5. Analisi dei dati

1. Per ogni giorno e di ciascuno, la media del mouse di 5 studi per dare una sola lunghezza percorso e la latenza di fuga per ogni soggetto di prova. Calcolare l'errore combinato in modo appropriato. Per il giorno 6, semplicemente raccogliere la lunghezza del percorso, la latenza di fuga, e il tempo trascorso nel quadrante piattaforma per ogni mouse.
2. Se le differenze esistono tra i gruppi al giorno 1, è probabile un problema con la visione piuttosto che apprendimento e memoria. Procedere solo con l'analisi delle differenze se non si vedono il giorno 1.
3. Confrontare le curve di apprendimento per giorni 2-5 utilizzando statistiche appropriate per il set di dati. Una curva più ripida rappresenta acquisizione compito più veloce; una curva meno profonda rappresenta un deficit nella acquisizione delle attività. I dati dal giorno 2 al giorno 5 vengono analizzati utilizzando ANOWA.
4. Per il giorno 6, confrontare la percentuale di tempo trascorso nel quadrante piattaforma precedentemente appreso, utilizzando statistiche appropriate per il set di dati. Una percentuale più alta di tempo trascorso nel quadrante piattaforma viene interpretato come un più alto livello di ritenzione della memoria.

6. Rappresentante Risultati

Abbiamo usato il test di Morris Water Maze di esaminare effetti dell'ipossia sul patogenesi dell'Alzheimer (7) e l'acido valproico (VPA) 's potenziale farmaceutica per il trattamento d. (6) in topi transgenici modello di AD. La Figura 3 è il risultato di rappresentanza abbiamo riportato nel nostro studio sull'effetto VPA sul deficit di memoria nel modello del mouse APP23 dC (6). Il giorno 1 (prove piattaforma visibile), non vi è alcuna differenza tra il VPA trattati e gruppi di controllo in latenza (Fig. 3A) e la lunghezza del percorso (Fig. 3A) che indica che entrambi i gruppi motore sono simili e le capacità visive. Da questo si assume i topi sono in grado di vedere la contrassegnato-piattaforma e gli spunti in ambiente circostante, e può fare il bagno accettabile. Per i giorni 2-5 (Giorno 1 a 4 di prove piattaforma nascosta) l'esempio mostra la differenza nella latenza fuga (Fig. 3C) e la lunghezza del percorso (Fig. 3D) tra i gruppi, suggerendo che i topi trattati con VPA risultati significativamente migliori rispetto ai controlli nel tempo. La sonda risultati pista l'ultimo giorno (giorno 6) mostrano che il numero di volte in cui i topi viaggiato nel terzo quadrante, in cui la piattaforma di nascosto era già piazzata, è risultata significativamente maggiore con il trattamento con VPA rispetto ai controlli (Fig. 3E). Questi dati indicano che il trattamento con VPA migliora significativamente i deficit di memoria visto in APP23 topi.

Figura 1. L'installazione delle attrezzature per la giornata di test d'acqua Morris visibile piattaforma Maze. La piscina è al riparo dal sperimentatore con divisori. Indizi spaziali si trovano sulle pareti, e forse sul posto all'interno della piscina, al di sopra della superficie dell'acqua, se lo si desidera. La piscina è riempita con acqua pulita, con la piattaforma situata 1 cm sopra la superficie. Una bandiera è stato messo sulla piattaforma per migliorare la visibilità.

Figura 2. Cattura dello schermo dal Qualsiasi-Maze ™ Video System Monitoraggio dimostrando di calibrazione piscina. La piscina è visto dall'alto da una telecamera in bianco e nero monitoraggio analogico con un digitalizzatore RTV24. Varie zone sono definite all'interno del software e la piscina totale è suddivisa in 4 quadranti. A, quinta zona piattaforma viene inserito, che può variare tra le prove, con cinque posizioni possibili: NW, NE, S, SE, o Centro. Una linea di calibrazione (linea spuntata sul centro) viene aggiunto per consentire al software per convertire i pixel in distanze distanze fisiche.

Figura 3. Risultati rappresentativi per la Maze Acqua Morris. Il 7 mesi APP23 topi transgenici portatori del gene mutante umano svedese APP sono stati testati dopo un mese di giorno VPA (n = 30 topi) o soluzione di veicolo (n = 30 topi) iniezioni. (A) durante il primo giorno di test della piattaforma visibile, il VPA trattate e di controllo APP23 topi mostravano una latenza simile a fuggire sulla piattaforma visibile. P> 0,05 da studente t-test. (B) Il VPA-trattamento e di controllo APP23 topi simili distanze nuoto prima di fuggire sulla piattaforma visibile nel test piattaforma visibile. P> 0,05 da studente t-test. (C) Nei test piattaforma nascosta, VPA trattati APP23 topi ha rilevato una latenza più breve per uscire sulla piattaforma nascosto ^il 3 e il 4 ^° giorno, p <0,001 per ANOVA. (D) VPA APP23 topi trattati avevano una lunghezza più corta di nuoto prima di fuggire sulla piattaforma nascosto sul 3 ^° e 4 ^° giorno, P <0,01 da ANOVA. (E) Nello studio sonda sul 6 ° giorno, il VPA trattati APP23 topi viaggiato nel terzo quadrante, in cui la piattaforma di nascosto era già piazzata, tempi significativamente più rispetto ai controlli. * P <; 0,005 da studente t-test. (Adattato e ristampato da The Journal of Experimental Medicine 205, 2781-2789, 2008, Rockefeller University Press, originariamente pubblicato nel Exp Med J. doi:... 10.1084/jem.20081588) (6).

Tabella 1. Campione di acqua labirinto * protocollo
* Si noti come sia la posizione della piattaforma di partenza e cambiare direzione al giorno 1, mentre nei giorni 2-5 la posizione della piattaforma rimane costante mentre la direzione cambia di partenza. Il giorno 6, non esiste una piattaforma e un singolo trial. La direzione di partenza per il giorno 6 è più lontano dalla posizione della piattaforma precedente (SW) in modo che i topi devono percorrere una certa distanza prima di entrare nel quadrante piattaforma precedentemente apprese.

Età, sesso, specie, e le differenze ceppo influenza le prestazioni MWM (8). Gli studi indicano che i topi di età compresa hanno scarse prestazioni nella MWM, mentre i roditori maschi prestazioni migliori rispetto alle femmine, in più, flottante è più marcato nei topi rispetto ai ratti (9, 10). Pertanto, questi elementi dovrebbero essere equiparata in tutti i test. L'evidenza suggerisce anche che gli animali hanno sottolineato eseguire più male nel MWM (11), quindi i fattori ambientali che possono causare stress, quali temperatura, luce e rumore, deve essere monitorata e mantenuta costante durante tutto il compito.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con l'Università di cura degli animali Columbia britannica e il comitato Usa e le linee guida CIHR.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), la Famiglia Townsend, e Jack Brown e Famiglia Alzheimer Research Foundation (a WAS). WS è titolare del Canada Research Chair nella malattia di Alzheimer. PL è stato sostenuto da un NSERC Premio Alexander Graham Bell Canada Graduate Research Borsa di studio di dottorato e un Michael Smith Fondazione per Studentship Graduate Research Salute Senior.

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