La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal Skin and Melanoma Progression. J. Vis. Exp. (54), e2937, doi:10.3791/2937 (2011).

La mayoría de los estudios in vitro en la biología de la piel experimentales se han realizado en los monocultivos de dos dimensiones (2D), mientras que la evidencia acumulada sugiere que las células se comportan de manera diferente cuando son cultivadas en un 3D matriz extracelular y también interactuar con otras células (1-5) . Los modelos de ratón han sido ampliamente utilizados para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo. Sin embargo ratón y la piel humana tiene diferencias significativas en la arquitectura celular y la fisiología, lo que hace difícil extrapolar los estudios en ratones a los seres humanos. Dado que los melanocitos de la piel del ratón son en su mayoría localizadas en los folículos pilosos, que tienen distintas propiedades biológicas de los humanos, que localizan principalmente en la capa basal de la epidermis. El desarrollo reciente de la piel humana en 3D los modelos ha permitido reconstruir el campo para investigar célula-matriz y célula-célula la interacción entre diferentes tipos de células. El reconstruye consistirá en una "dermis" con fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno I, un "epidermis", que se compone de queratinocitos estratificada y diferenciada y una membrana basal funcional, que separa la epidermis de la dermis. El colágeno proporciona andamios, transporte de nutrientes, y las posibilidades de interacción de célula a célula. Los modelos de piel en 3D que incorpora células melanocíticas recapitular las características naturales de la homeostasis de los melanocitos y la progresión del melanoma en la piel humana. Como in vivo, los melanocitos de la piel reconstruida se localizan en la membrana basal intercaladas con queratinocitos capa basal. Las células del melanoma exhiben las mismas características que reflejan la etapa del tumor original (RGP, VGP y células metastásicas de melanoma) en vivo. Recientemente, las células madre dérmicas han sido identificados en la dermis humana (6). Estas células madre multi-potentes pueden migrar a la epidermis y se diferencian de los melanocitos.

1. La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo:

1. Preparación de la capa acelular: Mezclar los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml en hielo: 0,59 ml de EMEM 10 veces, 50 l 200 mM L-glutamina, 0,6 mL de SFB, 120 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y 4,6 ml de colágeno bovino I. Añadir 1 ml de la mezcla en cada inserción de las bandejas de cultivo de tejidos. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y permitir que el gel se seque. Color de la mezcla debe ser de color amarillo pajizo al color de rosa.
2. Trypsinize fibroblastos humanos de los frascos de cultivo con el 0,25% de tripsina / EDTA, añadir DMEM con 10% de SFB para neutralizar. Recoger las células por centrifugación y se resuspenden 0,45 x 10 ⁶ células en 1,5 ml de DMEM con FBS al 10%. De las células madre dérmicas, recoger 6.600 esferas dérmica (cuando las células madre dérmicas crecer en medio de células madre, que forman las esferas de una manera similar a neuroesferas) tocando frasco para separar las esferas, la centrifugación.
3. Preparación de la capa celular: Mezclar los siguientes en un tubo de 50 ml en hielo: 1,65 ml de 10X EMEM, 150 l 200 mM L-glutamina, 1,85 ml de SFB, 350 l de bicarbonato de sodio al 7,5%, 14 ml de colágeno I bovino y 1,5 ml de suspensión de fibroblastos desde el paso 2 (otra alternativa es utilizar una combinación de 0,45 x 10 ⁶ fibroblastos dérmicos y 6600 las esferas en 1,5 ml de la piel reconstruir medio que para las células madre dérmicas reconstruye), mezclar bien. Añadir 3 ml de la mezcla a cada capa acelular recubierto de inserción. Incubar durante 45 min a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora de cultivo de tejidos. Color de la mezcla debe ser de color amarillo pajizo con rosa. Después de que el gel se solidifica, añadir DMEM conteniendo FBS al 10% (2 ml en el interior y 10 exterior ml de insertar en cada pocillo de la piel reconstruir las bandejas). Incubar durante 4 días y asegurarse de que los contratos de gel.
4. Aspirar medio de dentro y fuera de cada inserción. Añadir lavado medio (HBSS con el 1% de SFB dializados) 2 ml en el interior y 10 ml en el exterior de inserción con el fin de lavar el suero normal. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.
5. Preparación de la piel reconstruir medio:
   1. Por normal de las células madre de melanocitos dérmicos y reconstruye: Para medio básico (500 ml), mezclar los reactivos siguientes: 490 ml de queratinocitos medio libre de suero, 1,8 ml de extracto hipofisario bovino, 10 ml de suero fetal bovino dializado, 500 l de 10 mg / mL SCF, 562,5 l de 4 mg / mL bFGF y 500 l de 264 mg / mL ET-3. Medio I: Añadir 10 l de medio FEAG ml 100 mg / ml y 100 básica. Medio II: Añadir 2 FEAG l de 100 ml de medio básico. Medio III: Añadir 720 l de CaCl ₂ 1 M de 300 ml de medio básico.
   2. Para la piel melanoma reconstruir: Para hacer media I (100 ml), mezclar los reactivos siguientes: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona l de 269 g / ml, 200 ITES l de 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 l de adenina de 90 mm, 200 l de progesterona 2 nM, 240 l de _CaCl2 1 M, 200 triyodotironina l de 10 nm y 100 l de suero chelexed ternero recién nacido (disolver 3 g de Chelex 100 en 100 ml de suero, revolver 1,5 horas a 4 ° C, filtro de esterilización). Para hacer media II (100 ml), mezclar los reactivos siguientes: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona l de 269 g / ml, 200 ITES l de 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 l de adenina de 90 mm, 200 l de progesterona 2 nM, 240 l CaCl2 de 1 M, 200 triyodotironina l de 10 nm y 100 ul suero ternero recién nacido. Para hacer media III (300 ml), mezclar los reactivos siguientes: 142,5 ml de DMEM, 142,5 ml de F12 (HAM), 6 mL de L-glutamina de 200 mm, 600 hidrocortisona l de 269 g / ml, 600 ITES l de 500X , 600 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 l de adenina de 90 mm, 600 l de progesterona 2 nM, 720 l de _CaCl2 1 M, 600 triyodotironina l de 10 nM y 6 ml de suero ternero recién nacido.
6. Trypsinize queratinocitos humanos de los frascos de cultivo con 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar la tripsina de soja con inhibidor de tripsina (250 mg / L en 1x tampón fosfato salino), la desaceleración resuspender un sedimento celular de 4,17 x 10 ⁶ células / ml en la piel de la reconstrucción a medio I.
7. Trypsinize melanocitos o células de melanoma de frascos de cultivo con 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar la tripsina de soja con inhibidor de la tripsina, la desaceleración resuspender un sedimento celular en 0.83 x 10 ⁶ células / ml en la piel de la reconstrucción de mediano I.
8. Retirar la ropa medio de dentro y fuera de cada inserción.
9. Añadir la piel reconstruir medio I (1,5 ml para el interior y 10 ml en el exterior de cada inserción).
10. Tomar 600 l de suspensión celular de los queratinocitos y 600 l de suspensión de células melanocitos o células de melanoma, mezclar bien. Prescindir de 200 l gota mezclada suspensión de células por la caída en el interior de cada inserción. De las células madre dérmicas reconstruir, utilice 100 l de suspensión de queratinocitos solamente. Incubar durante 2 días a 37 º C.
11. Aspirar reconstruir la piel medio quetanto desde el interior y el exterior de cada inserción. Añadir la piel reconstruir medio II (2 ml para el interior y 10 ml en el exterior). Incubar durante 2 días a 37 º C.
12. Aspirar reconstruir la piel de mediano II desde el interior y el exterior de cada inserción, agregar 7,5 ml reconstruir la piel de mediano III sólo el exterior. Desde este punto, la superficie de la reconstruye empieza a ser expuesto al aire. Cambio de medio III en días alternos hasta el día 18.
13. La piel de la cosecha reconstruir el día 18:
    1. Aspirar los medios de comunicación desde el interior y el exterior de las inserciones.
    2. Retire de la bandeja de inserciones con las pinzas.
    3. Cortar la reconstrucción (incluyendo el filtro de policarbonato), trazando un círculo cerca del borde con una hoja de bisturí.
    4. Cortar la reconstrucción y el filtro en la mitad sobre una superficie dura.
14. Para las secciones de parafina: el lugar de la mitad de la reconstrucción en un cassette histología entre dos papeles de negro TBS biopsia y disfrutar de la cinta entera en formol al 10% por más de 4 horas. A continuación, coloque el cassette en el 70% de etanol y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para procesar la reconstrucción de inclusión en parafina.
15. Para las secciones de congelados:
    1. Coloque la otra mitad de reconstruir en el 50% de sacarosa a 4 ° C durante 1-2 horas, a continuación, cambiar la sacarosa 2M y lo almacenan a 4 ° C durante 1-2 horas.
    2. Prescindir de los medios de comunicación de corte óptima temperatura de congelación (OCT) en un molde de base disponible para que ocupe el 50% de la embarcación. Evitar las burbujas en la OCT.
    3. Agarra el borde de la reconstrucción con una pinza y retire la reconstrucción de la sacarosa. Colócalo en Kimwipes hasta el Kimwipes absorber la sacarosa.
    4. La transferencia de la reconstrucción en la base del molde en la parte superior de la OCT, el uso de fórceps y una espátula. Cubra la parte superior de la reconstrucción de octubre con más hasta que la base del molde está completamente llena. Asegúrese de que usted no tiene todas las burbujas de octubre en el que se hará el corte difícil.
    5. Coloque la base del molde de manera uniforme sobre el hielo seco triturado, y permitir que el octubre de congelar por completo.
    6. Envuelva la base del molde en papel de aluminio y lo almacenan a -70 ° C hasta que esté listo para cortar con un criostato.
16. Injerto de piel en la reconstrucción de un ratón:
    1. Preparar un tubo Falcon de 50 ml con 5 ml de DMEM (para congelar y descongelar la piel del ratón).
    2. Use una hembra de ratón SCID outbred pelo alrededor de 6 semanas.
    3. El ratón es anestesiados con (sistema de anestesia EZ) isoflurano: la anestesia inicial se realiza en la cámara de inducción con isoflurano 4% (antes de que el ratón se mueve en el lecho quirúrgico) y mantener la anestesia a través de un respiradero del cono de nariz durante el procedimiento (isoflurano: 1,5-2% ). El calor ayuda de un cojín calentado para prevenir la hipotermia y el lubricante oftálmica estéril aplicada para evitar lesiones oculares durante la anestesia.
    4. Ponga 600 ml de agua en un vaso y dejar en la parte superior de un plato caliente para mantener la temperatura del agua entre 40 - 60 ° C.
    5. Limpie la piel del ratón con la tintura de benjuí compuesta e hisopos con alcohol de preparación.
    6. Marcar una línea en la parte superior de la espalda del ratón para mantener la misma posición de sutura después.
    7. Corte un lecho de la herida alrededor de 1,2 cm de diámetro en la parte posterior superior del ratón usando tijeras y pinzas de Iris. Cubra la herida con gasas estériles. Poner la piel de ratón ronda en 5 ml de DMEM, luego dejar en el contenedor de nitrógeno líquido hasta que totalmente congelados. Descongelar el tubo en agua caliente en la parte superior de una placa caliente hasta que estén completamente descongeladas. Repetir 3 veces.
    8. Separe la piel de reconstruir a partir de la Transwell con hoja de bisturí y quitar la membrana con mucho cuidado, la transferencia de la piel reconstruir (lado epidermis hacia arriba) en la parte superior del lecho de la herida.
    9. Lugar de la piel del ratón (lado epidermis hacia arriba) en la parte superior de la piel reconstruir.
    10. Hacer la primera sutura en el marcador antes marcados, el segundo en la parte inferior, a continuación, dos puntos de sutura más en los lados para fijar la piel de ratón.
    11. Limpie la piel del ratón después del injerto. Quitar ojiva y mantener ratón en el teclado se calienta hasta que despierto y ambulatoria.
    12. Poner el ratón en una jaula nueva.
    13. Analgesia post-operatorio: Meloxicam (1 mg / kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía, 24 y 48 horas después de la cirugía.

2. Los resultados representativos:

Reconstruye la piel con melanocitos normales y células dérmicas madre
La piel se reconstruye se cultivan en un especial de 6 y bandeja con insertos. El compartimiento de la dermis se cultivaron en DMEM con FBS al 10% para los primeros cuatro días (Fig. 1A). La piel reconstruir medio que se utiliza cuando los queratinocitos se siembran con los melanocitos o células de melanoma (Fig. 1B). La epidermis es expuesto al aire en el día 9 y esto permite que los queratinocitos de diferenciar (Fig. 1C). En el día 18, la epidermis de la piel reconstruye está compuesto por capas estratificadas de queratinocitos. La capa basal indiferenciada y capas secuencialmente diferenciados se orientan verticalmente (Fig. 1D). Manchación de la sección reconstruye con la melanocíticos S100 marcador muestra que los melanocitos se alinean en la capa basal de la epidermis y se comunican con los queratinocitos a través de múltiples extensiones dendríticas (Fig. 1E). El compartimiento de la dermis contiene fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno tipo I. Depositado colágeno IV indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis (Fig. 1F). Cuando las células madre dérmicas (marcado con GFP lentiviral vector) se encajan con los fibroblastos en una matriz de colágeno I, emigran a la epidermis y se diferencian en melanocitos (1), (Fig. 2). Las múltiples capas de queratinocitos de la epidermis se desarrollan.

Reconstruye la piel de los tumores de melanoma
Los estudios clínico-patológicos indican que los melanomas progreso en una forma gradual: los nevos adquiridos comunes, nevos displásicos, RGP (fase de crecimiento radial) melanomas, VGP (fase de crecimiento vertical) y melanomas metastásicos melanomas (7). Las diferentes etapas de líneas celulares de melanoma son morfológicamente similares entre sí en 2-D de cultivo (Fig. 3A-D), pero cuando se incorporan en la piel reconstruye, el comportamiento de las células refleja sus características en vivo. La ubicación y la tasa de crecimiento de melanocitos normales son estrictamente controlados en la piel reconstruye (Fig. 3E). RGP principal melanomas WM35 proliferan sobre todo en la epidermis (Fig. 3F), mientras que los melanomas VGP WM793 crecer invasiva en la dermis (Fig. 3G). Metastásico melanomas 1205Lu agresiva invadir profundamente en la dermis (Fig. 3H).

Figura 1. Reconstruye la piel con melanocitos normales. El aspecto macroscópico de la piel reconstruye se muestra en la AC. Los fibroblastos A. mezclado con colágeno son cultivadas en DMEM con 10% de SFB y compartimiento de la forma cutánea. B. Los queratinocitos y los melanocitos se siembran en la parte superior de la dermis y crecer en la piel reconstruir medio. C. La epidermis es expuesto al aire en el día 9. D. H & E manchadas de la piel se presenta la reconstrucción de la epidermis compuesta vertical, orientada a la capa basal, y de forma secuencial las capas de células diferenciadas estratificado. La dermis contiene fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno tipo I. E. S100-positivo melanocitos (flechas en negro) se alinean en la membrana basal y se comunican con múltiples queratinocitos. F. El colágeno IV-tinción indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Todos los marcajes en el DF se realizaron en fijado en formol e incluidos en parafina secciones.

Figura 2. Células de la dermis de la piel del tallo reconstruye migrar a la epidermis y se diferencian en melanocitos. En el día 5 después de la siembra de los queratinocitos, las células individuales GFP-positivo (verde) de iniciar la migración hacia fuera de las esferas. La epidermis está todavía compuesta de una sola capa. A los 8 días, unas pocas células llegar a la interfaz de la epidermis-dermis. El día 10, las buenas prácticas agrarias de células positivas están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal. La GFP-positivas las células migran en el marcador epidermis expresar melanocíticos HMB45 (rojo, como indican las flechas blancas). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). La epidermis se desarrolla en forma de capas múltiples. La membrana basal está indicada con líneas blancas punteadas.

Figura 3. Reconstruye la piel de las diferentes etapas de los melanomas: AD. Melanocitos normales y células de melanoma en cultivos 2D. A. Los melanocitos del prepucio. B. RGP WM35 células. C. VGP WM793 células. D. las células del melanoma metastásico 1205Lu. E. melanocitos normales se encuentran en la membrana basal. F. RGP melanoma WM35 las células crecen en grupos de células en la epidermis. G. VGP melanoma WM793 células invaden la dermis a través de la membrana basal. H. melanoma metastásico 1205Lu agresiva células invaden profundamente en la dermis.

Solución de problemas

Hemos descrito la generación de la piel 3D reconstruye con melanocitos humanos normales, células de la piel del tallo y las células del melanoma. Cuando se cultiva en un cultivo monocapa, las células pigmentadas presentan una morfología similar (aplanado, eje o más dendríticas en forma), independientemente de su origen de la etapa clínica. En contraste, la piel 3D reconstruye recapitular etapa específica de las propiedades de las células del melanoma. Normal de melanocitos humanos residen en la membrana basal entre la epidermis y la dermis como células individuales. Las células de melanoma primario RGP crecer como pequeños grupos a lo largo de la membrana basal mientras que las células VGP más agresivo melanoma creciendo a medida que grandes grupos romper a través de la membrana basal en la dermis. Las células de melanoma metastásico crecer en todas direcciones e invadir profundamente en la dermis como células individuales o grupos. El análisis cuantitativo se puede realizar en este modelo, midiendo la profundidad de la invasión y el grado de proliferación. Además de la caracterización de las células melanocitos normales y malignos, utilizando el modelo que directamente puede inducir la diferenciación de las células madre dérmicas en los melanocitos madurado, que el hogar de la capa basal de la epidermis y establecer una comunicación de buena fe con los queratinocitos a través de la regulación positiva de la E-cadherina ( 6).

Usando vectores virales, que son capaces de activar o desactivar la función del gen para una mejor comprensión de la dinámica y la importancia funcional de los genes expresados ​​por cada tipo de células en la piel reconstruye, que promete ser un modelo eficiente para estudiar no sólo los mecanismos de transformación de los melanocitos , sino también la progresión del melanoma (8). Observación a largo plazo de fenotipos de células ha sido posible a través de injertos de piel reconstruye a animales inmunodeficientes. Como un ser humano de la piel del ratón quimera es una excelente herramienta de investigación para estudiar melanomagenesis y metástasis de melanoma.

Reconstruye la piel también puede ser una plataforma útil para la evaluación de medicamentos. Muchos medicamentos que erradicar células de cáncer en condiciones de cultivo 2D a menudo tienen poco efecto en solicitudes experimentales como clínicos. Como se observa en el tumor en vivo, las células del melanoma en cultivos de 3D ​​a menudo son resistentes a los fármacos que las células en cultivos de responder a las 2D, lo que sugiere que el microambiente modula las vías de señalización en el melanoma. Para el descubrimiento de fármacos con éxito, la piel 3D reconstruir el modelo es una herramienta ideal preclínicos para predecir los efectos de los compuestos in vivo (9,10).

En resumen, la piel reconstruir modelos de cerrar la brecha entre in vitro e in vivo. Que conducirá a una mejor comprensión de cuáles son los genes involucrados en la transformación y cómo las células madre contribuyen a esa transformación.

No hay conflictos de interés declarado.

Damos las gracias al Fondo del Instituto Wistar Animal, Servicio de Microscopía, el Fondo para Histotechnology y el Centro de Investigación de suministro. Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de CA 076674, 098101 CA, CA y CA 10815 025874.

1. Sun, T., Jackson, S., Haycock, J.W., & MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-81 (2006).
2. Smalley, K.S., Lioni, M., & Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42 (8-9), 242-7 (2006).
3. Sun, T., Norton, D., McKean, R.J., Haycock, J.W., Ryan, A.J., & MacNeil, S. Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1318-28 (2007).
4. Kremer, M., Lang, E., & Berger, A. Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system. Langenbecks Arch Surg. 386 (5), 357-63 (2001).
5. Escámez, M.J., García, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J.L. & Del Río, M. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. J Invest Dermatol. 123 (6), 1182-91 (2004).
6. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J.T., & Herlyn, M. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).
7. Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M.Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D.E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T.M., Donatien, P., Crombleholme, T.M., & Herlyn, M. Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF. Am J Pathol. 156(1), 193-200 (2000).
8. Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S.M., Elder, D.E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K.L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., & Xu, X. The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes. Am J Pathol. 174(6), 2367-77 (2009).
9. Lee, J.T., Li, L., Brafford, P.A., van den Eijnden, M., Halloran, M.B., Sproesser, K., Haass, N.K., Smalley, K.S., Tsai, J., Bollag, G., & Herlyn, M. PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas. Pigment Cell Melanoma Res. 23(6), 820-7, (2010).
10. Tsai, J., Lee, J.T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N.K., Sproesser, K., Li, L., Smalley, K.S., Fong, D., Zhu, Y.L., Marimuthu, A., Nguyen, H., Lam, B., Liu, J., Cheung, I., Rice, J., Suzuki, Y., Luu, C., Settachatgul, C., Shellooe, R., Cantwell, J., Kim, S.H., Schlessinger, J., Zhang, K.Y., West, B.L., Powell, B., Habets, G., Zhang, C., Ibrahim, P.N., Hirth, P., Artis, D.R., Herlyn, M., & Bollag, G. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3041-6 (2008).

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