コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

1。綿の苗を育て

1. アップランド綿（チョウ目害虫抵抗性ワタ）、様々なFibermax 832、Phytogen 425RF、Phytogen 480WRおよびメトロミックス700（SunGR、Beavile、ワシントン州）を含むポット（直径7cm）でDeltapine 90の種をまく。
2. 23℃プラスチックドームで覆われているトレイにポットを保つ成長室で12時間light/12時間暗光周期と° C、120μEM ^-2 S ^-1の光、。
3. two子葉が浮上しているドームを取り外します。
4. 約2週間後、VIGSアッセイの2つの完全に展開された子葉と植物を使用してください。この段階では、真の葉はまだ（図1）浮上していない。

2。 GrCLA1​​遺伝子を運ぶVIGSベクターを構築

1. G.のcDNAライブラリーからプライマーGrCLA1 ​​- Fを用いるPCR、5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3'とGrCLA1 ​​- R、5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3'で綿のCloroplastos alterados 1遺伝子（GrCLA1）を増幅するraimondii葉組織。
2. EcoRIとKpnIでGrCLA1 ​​のPCR産物を消化し ​​、ライゲーションによってpYL156（pTRV - RNA2）ベクターに挿入する。
3. カナマイシンの濃度50μg/ mLを含むLB寒天プレート上でクローンをスクリーニングする。制限酵素消化およびシーケンシングにより構造を確認してください。
4. エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンス GV3101にプラスミドをトランスフォームし、28℃のLB液体培地で回復℃のLBとプレート+カナマイシン（50μg/ mlの）+ゲンタマイシン（25μg/ mLの）上で形質転換体を選択してください。バクテリアは、-80℃で長期使用のため25％グリセロールで保存することができます。

3。 VIGS接種を行います

1. カナマイシンの濃度50μg/ mLを含むLB寒天プレート上RNA2 - GrCLA1：接種の3日前、pYL192（TRV）を保持するアグロバクテリウムツメファシエンスの縞凍結グリセロールストック：RNA1、pYL156（TRV）：RNA2（ベクターのみ ​​）とpYL156（TRV）と25μgの/ゲンタマイシンのmLの。 24時間、28℃で培養する。
2. VIGSの浸潤への2日前には、上記のプレートから各構成要素のために単一コロニーを採取し、カナマイシン50μg/ mLのとゲンタマイシンの25μg/ mLのを補充したLB培地5mLにそれを接種する、28で細菌培養を育て° 50rpmの速度でローラードラムで一晩のためのC。
3. と20μMのアセトシリンゴン - カナマイシン50μg/ mLのとゲンタマイシンの25μg/ mLの、プラスの10mM MES（（4モルホリノ）エタンスルホン酸2）を補充したLB培地50mLでフラスコに、上記の文化を移す。 ° C〜50 rpmの速度でシェーカーで一晩のために28で文化を育てる。
4. 次の日に、5分間4000rpmでアグロバクテリア細胞をスピンダウンし、10mMのMgCl _2、10mMのMESおよび200μMのアセトシリンゴンを含む浸透バッファに文化を再サスペンド。 1.5文化のOD 600を調整します。
5. 3時間室温でベンチに文化を残す。
6. Agrobacterial浸潤に先立って、パンチ子葉を通して貫通せずに25 Gの針を持つ綿の植物の子葉の裏面。一つまたは二つの穴は、（組織の柔らかさに依存する）子葉の各セクション（図2）にパンチした。
7. 1:1の比でRNA2 - GrCLA1、手には1を使用して負傷サイトを通じて子葉の下側から混合物を浸透させる：RNA1とpYL156（TRV）：：RNA2またはpYL156（TRV）pYL192のAgrobacterial培養懸濁液（TRV）を混在させるmLの無針注射器（図3）。
8. プラスチックドームで植物をカバーし、一晩薄明かりの状態で、室温で浸透した植物を残す。
9. 12時間の明/ 12時間暗のサイクルで23℃、120μEM ^-2 S ^-1の光の温度と成長のお部屋に植物を移す。

注：VIGSは、植物が23 ° Cまたは温室（25〜28 ° C）のどちらか下にあるときに動作する。温度が比較的低い場合（23〜25℃）、それは接種と表現型のためにより高い（28-30 ° C）または変動温度に比べてより均一であるほうが簡単です。ドームで植物を覆うこともVIGSがより効率的になります。

10. 7〜8日後の浸潤におけるサイレンシング表現型を調べます。 pYL156（TRV）によって沈黙植物の真の葉：RNA2 - GrCLA1 ​​はアルビノ表現型（図4）を表示するために始めた。アグロバクテリウムキャリングpYL156（TRV）を浸透植物：RNA2はコントロールとして使用。
11. コントロールと沈黙綿の植物から単離されたRNAを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）を用いて内在性遺伝子の発現レベルを調べることにより、遺伝子サイレンシングの効率を確認してください。

注：TRVは広い宿主範囲を持っていると届出病原体であるとしてVIGS - edの植物が含まれている検疫条件および植物の下に保持されるべきは、適切にオートクレーブし、アッセイ後に廃棄する必要があります。

4。代表的な結果：

約2週間Agrobacterial混合物と手浸潤した後、GrCLA1 ​​サイレンシングによって引き起こさアルビノ表現型が明らかに本当の葉で観察された。サイレンシングの効率は50以上の植物を使用して複数の実験でほぼ100％に達する。沈黙の植物は、新たに兄の葉（図4）上にモザイクの葉を開発する上で均一に分布し、非常に強力なアルビノの表現型を表示します。

図 Agrobacterial浸潤のために使用される2つの完全に展開された子葉と約2週齢の段階で1。綿の苗。

図2。Agrobacterial浸透を容易にするために、25 Gの針を使用して綿の植物の子葉の下側に小さな穴をパンチング。

無針注射器を使用して傷のサイトを通じて、綿の子葉にAgrobacterial混合物の図3。ハンドの浸潤

図4。アルビノの表現型は、綿の植物を沈黙さVIGSに登場。四品種が表示されます。 A）Fibermax 832、B）Phytogen 480WR、C）Phytogen 425RF、D）Deltapine 90。

VIGSは、一時的に内在性遺伝子の発現をノックダウンにより、機能的なゲノミクス解析の強力なツールであることが証明されています。本研究では、我々はTRV -ベースのバイナリーベクターを利用することにより、アグロバクテリウムを介したVIGSを開発した。綿CLA1（GrCLA1）遺伝子サイレンシングの効率を監視するための視覚的なマーカーとして開発されました。我々は一貫して取得しているすべての品種で、真の葉の上に現れるアルビノ表現型によって示される遺伝子サイレンシング効率の100％は、約2週間後の浸潤から始まり、テストされています。しかし、ほとんど可能性が高い葉緑体の発達に大きな欠陥が原因である繊維や種子の段階、へと発展していない綿の植物をCLA1 -黙らせた。綿のVIGSの開発に成功は容易に機能喪失型のアッセイのための関心のある遺伝子を沈黙させる代替手段を提供し、高速に近づいポストゲノム時代⁸の綿機能的遺伝学/ゲノミクスの基盤となります。