使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

1。セットアップ

1. 図に示すように、外科領域を設定します。 1A、"。セットアップの主要なコンポーネントは、パッドとイソフルラン麻酔用気化器を加熱し、エッペンドルフFemtojetインジェクター、電極と針ホルダー、ライカのsteromicroscope、光ファイバー照明システム、ECM 830方形波のエレクトロポレーションシステムとナリシゲのマイクロマニピュレーターを含める。
2. 手術器具を超音波処理するためMetriclean2低発泡液を用いてBransonic超音波洗浄機ですべてのツールを清掃してください。オートクレーブしてツールを滅菌する。滅菌のツールは、Germexに保存されています。
3. 暖かい滅菌生理食塩水と滅菌乳酸リンゲル液で注射器を準備します。

2。麻酔

1. 小（幅12cm x 20cm）の麻酔チャンバー内の場所の動物。気化器を使用して、1L/min（図1A、'）、5％イソフルラン麻酔と酸素を提供する。特に、掃気システムを使用してイソフルラン排気を収集することが重要です。
2. 呼吸が深く、定期的になるとチャンバーから動物を取り外します。つま先の摘心と瞬目反射テストは、完全な麻酔を確保するために使用されています。
3. 加熱パッド（37℃）の上に、その裏に妊娠中のマウスを置きます。加熱パッドは、最初の70％エタノールで拭いて滅菌され、そしてその後滅菌、lintlessガーゼパッドで覆われている。手術中（2.25％）イソフルラン提供するために、呼吸器のチューブとマスク装置を使用してください。
4. うなじの皮膚の下に皮下ブプレノルフィンを（0.1mg/kg体重）注入。
5. 深いと定期的な呼吸のための手術中の動物を監視します。動物は浅くまたは急速に呼吸し、息をのむではありません。浅い、急速な呼吸は光麻酔の徴候である可能性があります、とイソフルランの流れを大きくする必要があります。動物が息を呑むに始まる場合、イソフルランの流れを減少させる。呼吸停止の場合には、イソフルランをオフにしてください、そして動物が回復するまで、酸素の流量を増加させる。低濃度でイソフルラン再起動します。

3。手術のための動物の準備

1. テープは、加熱パッドに動物の前肢と鈍鉗子で後足をつまんで撤回の応答のためにもう一度確認してください。
2. 滅菌綿棒を用いて、腹部に脱毛クリームの厚い層（すなわち、Nairさんを）広げ。会社のストロークで、下毛が完全に被覆されていることを確認してください。脱毛のための滅菌綿棒で断続的にチェックし、3分の平均を上にしておきます。滅菌水と滅菌ガーゼパッドを湿らせ、すべての痕跡がなくなるまで腹部を拭いてください。クロルヘキシジン（すなわち、Stanhexidine）皮膚、よりクリーンで水を繰り返します。清潔、滅菌ガーゼで腹部を乾かします。
3. より多くの滅菌水、続いクロルヘキシジン（すなわち、Stanhexidine）で切開部位を滅菌する。清潔、滅菌ガーゼで腹部を乾かします。 70％エタノールと新鮮な、滅菌綿棒を使用してこの手順を繰り返します。
4. 子宮角が手術中に引っ張られるときに経由する中間のスリットと腹部上に滅菌ガーゼのパッドを配置。

4。子宮角の切開と暴露

1. 子宮角を公開するには、最初に正中線での皮膚の下に薄い線のように白線を見つけます。鉗子を使用して、離れて腹壁から皮膚を引っ張ると皮膚のはさみ（長さ約1cm）と半ば腹部の下方から小さな、まっすぐに切開をカット。
2. 湾曲したピンセットやハサミを使用して、腹膜同じ処理を繰り返します。
3. 切開の上に小さな縦のスリットで滅菌ガーゼを置き、暖め滅菌生理食塩水で湿ら。
4. 切開に鉗子をスライドさせ、子宮を探します。子宮角を除去しながら鉗子で切開を開いたまま。
5. 慎重に第一および第二目に見える胚の間に子宮を把握し、ガーゼの上に胚を引き出します。 、子宮角の両側を削除する滅菌ガーゼの上に置くと、任意の再吸収や"不健康な"（例えば、より小さなボディのサイズ）胚を指摘し、胚の数を数えます。生理食塩水で子宮角を湿らせ、慎重に腹部に子宮の半分を返す。

5。心室へのDNAの注入

1. 外科用針が毛細血管とホウケイ酸マイクロピペットを用いてマイクロピペットプラー迸るサッターを用いて調製される（プログラム： 熱= 750、= 30、ヴェル= 90、時間= 150を引いて ）。滅菌外科用メスの刃を使用して、針の先端が軽く45度の角度で剃っています。
2. 針をロードするには、パスツールピペットを炎の下の細い直径に向かって引っ張られます。 （：メチルグリーン染色したDNAの注射を可視化することができます注）マウスピースは0.01％メチルグリーンと混合3mg/mlエンドトキシンフリーDNAの約10μlを策定するローディングピペットに添付されます。満たされた針は、マニピュレータのスタンドにマウントし、Femtojetインジェクタに接続されています。
3. 卵巣に最も近い胚を皮切りに、円形の鉗子それは注射が尾方向に吻側に行うことが可能なため、"顔フォワード"に配置されるように静かに脱落膜内で胚を有効にするために使用されています。照明用の光ファイバ光源は、吻側領域における大規模な側脳室（図1B、B'）で挟まれている胚の脳の正中線を視覚化するために使用されます。
4. 胚は、円形の鉗子を使用して位置に保持される。脳への参入の角度は約45度になるように針が子宮の上に配置されている。マイクロマニピュレータ、迅速かつ安定した動きを使用して、針の先端が子宮壁を通って胎児の側脳室に挿入されます。注射は、それぞれ、終脳、間脳や網膜をターゲットに側脳室、第三脳室または網膜下腔に向けている。胚の脳胞は側脳室に注入されたDNAは、第³脳室に流入するような初期胚の段階で開いていることに注意してください。
5. エッペンドルフFemtojetマイクロインジェクターを使用して、エンドトキシンフリーDNA（1-3μL）を注入するフットペダルを押してください。成功した注射は胎児脳室全体にメチルグリーン染料の拡散により容易に可視化される。針は、その後徐々に破損を避けるために、バックアップを描画することで削除されます。

6。エレクトロポレーション

1. 注入胚は（まだ子宮内）温めた生理食塩水で十分に母親の腹部とウェットを覆う滅菌ガーゼ上に配置されます。注意してください**膜表面への生理食塩水を添加すると電流の効率的な通過を可能にするために不可欠である。
2. GenePaddle電極は、DNAの注射後の子宮を把持するために使用されます。 40 50V、50ミリ秒の五平方電気パルスは、ECM8300 BTXのエレクトロポレーションシステム（図1C、C'）を使用して毎秒1つのパルスの速度で配信されます。
3. 保護濡れたガーゼで注入/エレクトロ胚をカバーし、次の胚を続ける。
4. 全ての所望の胚の注入/エレクトロポレーションが完了すると、慎重に腹部（図1D）に戻って子宮角を押してください。
5. 慎重に他の子宮角を取り出して、卵巣に最も近い胚を再び始める。

7。縫合およびステープル

1. 全ての胚が子宮内に戻るになったら、腹腔〜2〜3ミリリットル温かい生理食塩水に加える。
2. 傷を閉じるために、腹部にガーゼを除去し、腹膜の側面を識別することから開始。黒編みシルクラインを使用して腹膜を縫合開始。それは一般的に弱いと術後出血や感染につながる可能性があるとして、この手順には、吸収性縫合糸を使用することは推奨されません。胸骨に近い腹膜にラインを固定し、離れてアンカーからステッチに進んでください。すべての縫合糸が締まっている、そして基礎となる臓器や皮膚を誤って腹膜に縫い込まれていないことを確認してください。残りの縫合線をクリッピングして捨てる。
3. 鉗子で縫合線に対して閉じて肌を引き出します。反射9ミリメートル™皮膚閉鎖ステープルを使用して、ステープル縫合線の下をするように注意していないながら、傷口の皮膚を切り取る、またはあまりにも緊密に皮膚を引っ張るため。好ましい方法は、鉗子で体から皮膚を持ち上げ、保持、およびステープルツールを使って90度の角度でてくるのです。傷口が閉じられるまで続ける（約3ステープル）。完了したら、ステープルが優しく縫合糸のツール（図1D'）と一緒に押すことで締められていることを確認してください。

8。手術後のケア

1. 麻酔回復を監視するには、彼女の胃の上に女性のオンとイソフルランの電源を切ります。呼吸装置の内部に動物の顔を保ち、麻酔からの回復を助けるために3％まで酸素を上げてください。動物は、低体温を防ぐために加熱パッドの上に清潔な乾いたガーゼのパッドの上に配置する必要があります。
2. 動物が意識がもうろうとしたですが、動物の首の皮膚の下に皮下2mLのリンゲル液を注入する。
3. 奮起させる動物のために数分と温暖化のガーゼパッドのために酸素の流れの下で動物を押し続けます。それが正常な呼吸パターンに戻るように動物からの動きの短い噴出を観察する必要があります。動物は、意識と覚醒しそうになるまで数分間観察。
4. ゲンタマイシンスプレーで女性の腹部をスプレーし、滅菌ガーゼパッドで動物をラップ。
5. オートクレーブした寝具と段ボールの住宅と滅菌ケージに動物を譲渡する。
6. 水のボトルは、徹底的に、洗浄滅菌し、滅菌水で埋めなくてはなりません。 500mLの水にスルファメタジン抗生物質（25％株式）2 mLを加える。
7. 手術後の朝皮下0.05 mg / kgのブプレノルフィンを投与する。
8. 最初の24時間後に手術のために密接に女性を監視します。動物は長く24時間以上保存されている場合、女性が新しいマスターに移動​​されます2日目のILEケージ。

9。代表的な結果

新皮質

新皮質は、視覚と感覚運動処理と高次認知機能を担当するCNSの領域です。それは、それぞれ、背側と腹側終脳に由来するグルタミン酸作動性投射ニューロンとGABA作動性介在ニューロンで構成されています。新皮質の発達における異なる遺伝子の役割に対処するために、我々はどちらmisexpressに子宮内エレクトロポレーションに使用したり、背側または腹側終脳^1,3,4の異なる遺伝子の発現を（つまり、shRNAコンストラクトの使用による）がブロック。胚終脳での遺伝子をmisexpressに、我々は、CMV -βactinプロモーターエンハンサーと内部リボソーム侵入部位（IRES）、増強緑色蛍光タンパク質を含む、バイシストロンの発現ベクター（pCIG2）を使用して（EGFPを、pCIG2で）カセットを、トランスフェクションが可能落射蛍光（図2A - C）によって検出されるセル。我々は、E11.5からE15.5（。。図2に示すデータはE12.5にある）に終脳に発現コンストラクトを導入するこの技術を使用していました。胚は数日後にエレクトロポレーションを開発することによって、我々は、GFP -標識前駆細胞の分化と移行を追跡することができます。分化が進むにつれて、3日後にエレクトロポレーションGFP ⁺細胞が分化し、脳室帯（VZ）から移行し、脳室下帯（SVZ）との中間ゾーン（IZ）と皮質板（CP;図2C）に。 、基底前駆細胞（すなわち、Tbr2、E12.5に電気穿孔の脳は24時間後に分析されている場合、我々は、尖前駆細胞のマーカー（図2Aすなわち、Pax6）との共同ラベリングによる前駆細胞の成熟およびニューロン移動の前のイベントを監視することができます。図2B）と分裂新皮質の神経細胞（すなわち、Tbr1、図2C）。

間脳

視床下部は、内分泌と自律神経系の間のゲートウェイとしての中枢神経系との機能の腹側麓に位置しています。開発中に、成熟した視床下部を構成する複数の核は、共通の前駆細胞のゾーンから差別その行胚の間脳の腹側のほとんどの地域。現在のところ、前駆細胞の増殖、ニューロンの分化視床核の形成を調節する分子経路はよくわかっていない。我々はE12 embryos.Weの第³脳室にDNAを注入することにより、胚間脳にレポーター遺伝子の発現を標的とする子宮内エレクトロポレーションで使用されては、E14での神経細胞を分化におけるGFPの分布を追った。この方法論では、我々は成功視床、事前に視床と視床下部（図3A）にGFPの発現を標的にしている。冠状切片の分析は、我々が正常前駆細胞へのGFPの発現を標的としていることを明らかにその核を形成するために、マントルゾーンに出移行する第³脳室とニューロンのライン脳室帯（図3B）

網膜

網膜は、脳に伝送される電気インパルスに光子を変換する役割を担って目の神経層、である。それは胚の間脳のoutpocketingとして開発し、それゆえ、神経管から導出されます。神経網膜が網膜下腔、頭部間充織から目を分離空洞に隣接してある根尖前駆細胞のコンパートメントから開発しています。網膜前駆細胞へのDNA構築物を標的とするため、注射は、小さなターゲットエリアに作られている必要があります。マニピュレーターを使用して、我々は成功したE13.5からE15.5（。。図4に示すmCherryレポーターとPCICのE15.5エレクトロです）に​​胚のこの小さな地域を対象に管理している。 、、エレクトロ網膜は24時間後、トランスフェクションを検討している場合は、我々はそのほとんどmCherry ⁺細胞が分割前駆細胞が配置されている外側の神経芽細胞層（onbl）、ではなく、網膜神経節細胞層に配置されている（挿入画像GCL）を観察分裂細胞がどこにローカライズ。

図1。 子宮内エレクトロポレーションのセットアップと方法論の入門。（A）外科的なセットアップの主要なコンポーネントは、エッペンドルフFemtojetインジェクター（1）、ニードルホルダー（2）、ライカのsteromicroscope（3）、光ファイバー照明とナリシゲのマイクロマニピュレーターを含めるシステム（4）、電極（5）と加熱パッド（6）ECM 830方形波のエレクトロポレーションシステム。 （'）動物はイソフルラン麻酔用気化器を用いて麻酔です。 （B、B'）簡単に言えば、麻酔の後、子宮角を露出していると速いグリーンと混合したDNAは、胚の脳胞に注入される。成功注入は速いグリーン色素（B'）を追跡することによって可視化される。 DNAが正常に注入された後に（C、C'）、パドルの電極は子宮の両側に配置され、positiDNAは選択の脳領域への正極に向かって引っ張られるように胚をoning。 （D、D'）すべての必要な胚が注入されると、子宮は腹部（D）にプッシュバックされ、腹膜を縫合され、皮膚は（Dステープルされる'）。妊娠中の女性は、その後回復するために許可され、エレクトロポ仔は、所望の時点で収集されます。

図2。背側終脳のエレクトロポレーションの代表的な例。（AC）pCIG2で12.5日でエレクトロE13.5背側終脳を介して冠状断面の顕微鏡写真。電気穿孔GFP ⁺細胞が頂端前駆細胞（Pax6 ^+、赤、）、基底前駆細胞（Tbr2 ^+、赤、B）と分裂終了ニューロン（Tbr1 ^+、赤、C）のマーカーの発現について分析する。 cpは、皮質板、SVZ、脳室下帯、VZ、脳室帯。

図3。間脳エレクトロの代表的な例。（）pCIG2とE12でエレクトロれているE14脳の腹側ビュー。 GFP落射蛍光は、第³脳室全体にマイクロインジェクションpCIG2の広がりはプラスミド実証、視床、事前に視床と視床下部に表示されます。エレクトロ脳の冠状断面の（B）顕微鏡写真、脳室帯からGFP ⁺細胞の移動を示すし、視床下部核が形成されるマントルゾーン、に。 3V、第三脳室、T、視床、ハイ、視床下部、MZ、マントルゾーン、電話番号、終脳、プレタ、prethalamus、VZ、脳室帯。

図4。網膜エレクトロの代表例。神経節細胞層の外側の神経芽細胞層ではなく、Brn3b ⁺網膜神経節細胞におけるmCherry +細胞の蓄積を示すE15.5でPCICでエレクトロE16.5目で冠状セクション。挿入図は、箱入りの領域の高倍率の画像です。 GCL、網膜神経節細胞層、ル、レンズ、onbl、外側の神経芽細胞層、再度、網膜。

子宮内エレクトロポレーションは、発生過程の様々な分析に使用することができます。例えば、このようなGFP、mCherryまたはアルカリホスファターゼなどのレポーター遺伝子のトランスフェクションは、系統のトレースとニューロン移動の実験を行うために使用することができます。また、Creリコンビナーゼは、一時的に選択的に空間的および/または時間的に制御された方法でfloxed対立遺伝子を排除するために表現することができます。さらに、shRNAまたはドミナントネガティブ構築物は、ノックダウンの標的遺伝子の機能に電気穿孔することができます。最後に、野生型および/または遺伝的変異マウスラインの両方で重要な遺伝子の標的過剰発現またはmisexpressionは、細胞の運命決定を研究するために使用することができます。それは非常に短い時間の要因の多くの組み合わせのテストを可能にするため、このアッセイのハイスループットは非常に重要です。注意いずれかのノートでは、この手順では、細胞内の遺伝子発現に変化をもたらすを行うことであり、その針の侵入部位（すなわち、傷口にアップレギュレート傷害応答遺伝子;として私達と他の¹³で観測された）。それは、このように創傷部位の外側にエレクトロポレーションした細胞に集中することをお勧めします。最初にこのテクニックを学習する際に加えて、胚の生存率は低いですが、すぐに実践で> 95％に上昇。これまでに、我々は正常に終脳⁴ proneural bHLH型転写因子によって制御される遺伝子を同定するために子宮内エレクトロポレーション技術で使用されている。我々はまた、終脳のシス調節エレメント³の分析のためのこの技術の使用を検証しています。