Effektiv Gene Delivery i flera CNS territorierna Använda I Utero Elektroporation

1. Set-up

1. Set-up operationsområdet som visas i bild. 1A, A ". Viktiga komponenter i set-up ingår ett Eppendorf Femtojet microinjector, Narishige mikromanipulator med nål hållare, Leica steromicroscope, fiberoptisk belysning, ECM 830 Square Wave elektroporation System med elektroder, värmedyna och en förångare för isofluran bedövningsmedel.
2. Rengör alla verktyg med ett Bransonic ultraljudsrengörare med Metriclean2 Lågskummande lösning för sonicating kirurgiska verktyg. Sterilisera verktyg genom autoklavering. Steriliserade verktyg sedan förvaras i Germex.
3. Förbered sprutor med varm steril koksaltlösning och sterilt Ringer-laktat lösning.

2. Anestesi

1. Placera djuret i en liten (12cm x 20cm) anestesi kammare. Med hjälp av en Vaporizer, leverera 5% isofluran narkos och syre vid 1L/min (Fig. 1A, A "). Framför allt är det viktigt att samla isofluran avgaserna med hjälp av ett spolningssystem.
2. Ta bort djuret från kammaren när andningen blir djup och regelbunden. Toe klämmande och ögonblinkning reflex tester används för att säkerställa full narkos.
3. Placera gravid musen på rygg ovanpå en värmedyna (37 ° C). Den värmedyna först steriliseras genom att torka med 70% etanol, och täcks sedan över med en steriliserad, luddfri kompress. Använd en respirator tub och mask apparater för att leverera isofluran (2,25%) under operationen.
4. Injicera buprenorfin (0.1mg/kg kroppsvikt) subkutant under huden på nacken.
5. Övervaka djur under hela operationen för djup och regelbunden andning. Djuret ska inte dra efter andan, andas grunt eller snabbt. Ytlig, snabb andning kan vara ett tecken på lätt narkos, och flödet av isofluran bör ökas. Om djuret börjar kippa, minska flödet av isofluran. Vid ett andningsstillestånd, slå isofluran av, och ökar flödet av syre till djur har återhämtat sig. Starta om isofluran på en lägre koncentration.

3. Animal förberedelse för kirurgiskt ingrepp

1. Tape framben av djur till värmedyna och kontrollera igen för en dementi svar genom att klämma på bakhoven med trubbig pincett.
2. Använd en steril bomullspinne, spred ett tjockt lager hårborttagningskräm (dvs Nair) på buken. I fasta stroke, se till att bottenull är helt täckt. Låt verka i genomsnitt tre minuter, kontrollera intermittent med en steril ren bomullstops för hårborttagning. Blöt en steril kompress med sterilt vatten och torka av buken tills alla spår är borta. Upprepa med klorhexidin (dvs Stanhexidine) hud renare och mer vatten. Torka magen med ren, steril gasbinda.
3. Sterilisera snitt webbplats med en klorhexidin (dvs. Stanhexidine) följt av mer sterilt vatten. Torka magen med ren, steril gasbinda. Upprepa detta steg med 70% etanol och en fräsch, steriliserad bomullspinne.
4. Placera en steril kompress över buken med en skåra i mitten genom vilket livmoder horn kommer att dras under operation.

4. Snitt och Exponering av uterus Horns

1. Att exponera livmoder hornen först lokalisera linea alba som svag linje under huden vid mittlinjen. Använd pincett, dra huden från bukväggen och skär ett litet, rakt snitt från mitten av buken nedåt med huden sax (ca 1 cm långa).
2. Använda böjd pincett och sax, upprepa processen med bukhinnan.
3. Placera steril gasbinda med en liten vertikal springa över snitt och fukta med uppvärmd steril koksaltlösning.
4. Skjut pincett i snittet och leta reda på livmodern. Håll öppna snitt med pincett samtidigt ta bort livmodern hornen.
5. Ta försiktigt tag i livmodern mellan första och andra synliga embryon och dra embryon på gasväv. Ta bort båda sidor av livmodern horn, placera på steril gasbinda och räkna antalet embryon, notera eventuella resorption eller "ohälsosamma" (t.ex. mindre kroppsstorlek) embryon. Blöt livmodern horn med koksaltlösning och noggrant tillbaka hälften av livmodern i buken.

5. Injektion av DNA i ventriklarna

1. Kirurgiska nålar är förberedd med en Sutter Flaming Mikropipett Avdragare med borosilikat mikropipetter med kapillärer (Program: värme = 750, Pull = 30, Vel = 90, tid = 150). Med en steril skalpell bladet är nålspetsen försiktigt rakat av i 45 graders vinkel.
2. För att ladda nålen är Pasteur pipetter dras till en smal diameter under en låga. Ett munstycke ansluts till lastning pipetten att utarbeta ~ 10 ìl 3mg/ml endotoxin-fria DNA blandas med 0,01% metyl grön (notera: metyl gröna färgen gör att DNA-injektioner som ska visualiseras). Den fyllda Nålen är sedan monterat på en mikromanipulator stå och bifogas Femtojet injektorn.
3. Från och med embryot närmast äggstocken, runda pincettanvänds för att försiktigt vrida embryot inom decidua så att det sitter "ansikte framåt", vilket gör injektioner för att förekomma i en rostralt till stjärtfenan riktning. En fiberoptisk ljuskälla för belysning används för att visualisera mittlinjen den embryonala hjärnan, som flankeras av stora laterala ventriklarna i rostralt regioner (Fig. 1B, B).
4. Embryot hålls på plats med hjälp av cirkulära pincett. Nålen är placerad ovanför livmodern så att vinkeln träder i hjärnan är ca 45 grader. Använda mikromanipulator, och en snabb och stadig rörelse är nålspetsen in genom livmoderväggen och in i den laterala ventrikeln av embryot. Injektioner är riktade mot de laterala ventriklarna, 3: e ventrikel eller subretinal utrymme för att rikta telencephalon, diencephalon och näthinnan, respektive. Observera att den embryonala hjärnan blåsor är öppna i tidiga embryonala stadier så att DNA injiceras i de laterala ventriklarna kommer att flöda in i 3: ^e ventrikeln.
5. Tryck på fotpedalen för att injicera endotoxin-fria DNA (1-3 mikroliter) med hjälp av en Eppendorf Femtojet microinjector. En lyckad injektion är lätt synliga genom spridning av metyl gröna färgämnet i hela embryonala ventriklar i hjärnan. Nålen är sedan långsamt bort genom att dra tillbaka upp för att undvika brott.

6. Elektroporation

1. Den injicerade embryot (fortfarande i livmodern) är placerad på steril gasbinda överliggande moderns buk och våt grundligt med varm koksaltlösning. Observera ** Tillägget av koksaltlösning för att membranet ytan är avgörande för att möjliggöra en effektiv passage av en elektrisk ström.
2. GenePaddle elektroder används för att greppa livmodern efter injektionen av DNA. Fem kvadrat elektriska pulser av 40-50V och 50 ms levereras med en hastighet av en puls per sekund med en ECM8300 BTX elektroporation systemet (bild 1C, C ').
3. Täck den injicerade / electroporated embryo med skyddande våt kompress och fortsätta till nästa embryot.
4. Efter avslutad injektion / elektroporering av alla önskade embryon, Tryck försiktigt livmoder hornen tillbaka in i buken (fig. 1D).
5. Försiktigt bort den andra livmodern hornet och börja igen med embryot närmast äggstocken.

7. Sutur och häftning

1. När alla embryon är tillbaka i livmodern, lägga till bukhålan ~ 2-3 ml varm saltlösning.
2. För att stänga såret, börja med att ta bort gasväv på buken och identifiera sidorna av bukhinnan. Börja suturering bukhinnan med svart flätat silke linje. Det rekommenderas inte att använda absorberbara suturer för detta förfarande eftersom det är typiskt svagare och kan leda till postoperativa blödningar och infektioner. Förankra linjen på bukhinnan närmast bröstbenet och fortsätt att sy bort från ankaret. Se till att alla suturer är åtdragna och att inga underliggande organ eller huden har oavsiktligt sytts in i bukhinnan. Klipp de kvarvarande suturen linje och kasta.
3. Dra huden stängt över suturen linje med pincett. Använda 9 mm Reflex ™ huden stängning häftklamrar, gem huden över såret noga med att inte häfta ihop under suturen linje, eller att dra i huden för hårt. Den bästa metoden är att hålla huden uppåt och bort från kroppen med pincett, och komma in på en 90 graders vinkel med krampa verktyget. Fortsätt tills såret är stängt (cirka tre häftklamrar). När du är klar, se till klammer är täta genom att försiktigt trycka tillsammans med sutur verktyget (fig. 1D).

8. Postoperativ vård

1. För att övervaka narkos återhämtning, sväng hona på magen och stänger av isofluran. Att hålla djurets ansikte innanför andningsapparat, sväng syre upp till 3% för att bidra återhämtning från narkosen. Djuret ska placeras på en torr kompress ovanpå värmedyna för att förebygga hypotermi.
2. Medan djuret är groggy, injicera 2 ml Ringer-lösning subkutant under djurets hals hud.
3. Fortsätt att hålla djuret under syrgasflöde i flera minuter och värmande kuddar gasväv för att väcka djuret. Kort sprutar av rörelse från djuret bör observeras då det återgår till en normal andning mönster. Beakta under flera minuter tills djuret verkar medveten och vaken.
4. Spraya honans buken med Gentamicin spray och linda djuret i en steril kompress.
5. Överför djuret i en steril bur med autoklaveras sängar och kartong bostäder.
6. Vattenflaskor bör rengöras noggrant, steriliseras och fylld med sterilt vatten. Till 500 ml vatten och tillsätt 2 mL sulfamethazine antibiotika (25% lager).
7. Administrera 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant morgonen efter operation.
8. Övervaka kvinnliga noga för de första 24 timmarna efter operationen. Om djur hålls längre än 24 timmar, är kvinnor flyttat till nya STERile burar dag 2.

9. Representativa resultat

Neocortex

Det neocortex är den region i CNS som är ansvarig för visuella och sensomotoriska bearbetning och högre kognitiva funktioner. Den består av glutamaterg projektion nervceller och GABAergic interneuronen som härrör från rygg-och ventral telencephalon, respektive. För att hantera de roller olika gener i hjärnbarkens utveckling använder vi i livmodern elektroporering att antingen misexpress eller blockera uttrycket (dvs med hjälp av shRNA konstruktioner) av olika gener i rygg eller ventrala telencephalon ^1,3,4. Att misexpress gener i den embryonala telencephalon använder vi en bicistronic uttryck vektor (pCIG2), innehållande en CMV-βactin promotor-förstärkare och en intern ribosomen inträde plats (IRES)-förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP, i pCIG2) kassett, vilket gör att transfekterade celler som skall upptäckas av epifluorescence (bild 2A-C). Vi använde denna teknik för att införa yttrandefrihet konstruktioner i telencephalon från E11.5 till E15.5 (uppgifter som visas är E12.5,. Figur 2). Genom att låta embryon för att utveckla flera dagar efter elektroporation, kan vi spåra differentiering och migration av GFP-märkta stamceller. Som differentiering intäkter, 3 dagar efter elektroporation GFP ⁺ celler differentiera och migrera ut ur ventrikulära zonen (VZ), subventrikulära zonen (SVZ) och mellanliggande zon (iz) och in i kortikala plattan (bp;. Fig. 2C). Om hjärnor electroporated vid E12.5 analyseras efter 24 h, kan vi övervaka tidigare händelser i stamceller mognad och neuronala migreringen genom samarbete märkning med markörer för apikala stamceller (dvs Pax6;. Figur 2A), basala stamceller (dvs Tbr2; . Fig 2B) och postmitotic hjärnbarkens nervceller (dvs Tbr1;. Fig. 2C).

Diencephalon

Hypothalamus ligger i ventrala basen av CNS och fungerar som en gateway mellan endokrina och autonoma nervsystemet. Under utvecklingen, de många kärnor som utgör den mogna hypotalamus skilja från en gemensam stamfader zon som linjer ventral-mest regionen av embryonala diencephalon. För närvarande är de molekylära vägar som reglerar spridningen stamceller, neuronal differentiering och bildandet av hypotalamus kärnor dåligt kända. Vi använde i livmodern elektroporering att rikta uttryck reporter gen till den embryonala diencephalon genom att injicera DNA i den 3: ^e ventrikeln av E12 embryos.We följde därefter fördelningen av GFP att skilja på olika nervceller vid E14. Med denna metod har vi riktat framgångsrikt GFP uttryck till thalamus, pre-thalamus och hypothalamus (Fig. 3A). Analys av korona sektioner visar att vi framgångsrikt har riktat GFP uttryck progenitorceller som linje ventrikulära zonen i 3: ^e ventrikeln och nervceller som vandrar ut till mantel zon för att bilda kärnor (Fig. 3B)

Retina

Näthinnan är den neurala skikt i ögat, som ansvarar för att omvandla ljus fotoner till elektriska impulser som överförs till hjärnan. Det utvecklas som ett KONTANT av embryonala diencephalon, och därmed kommer från neuralrörsdefekter. Den neurala näthinnan utvecklas från en apikala stamceller fack som ligger intill subretinal utrymme, en hålighet som skiljer ögat från huvudet mesenkym. Inriktning DNA-konstruktioner till retinal stamceller kräver därför att injektioner görs till ett litet målområde. Använda micromanipulators har vi lyckats att lyckas rikta detta lilla område i embryon från E13.5 till E15.5 (visas är E15.5 electroporations av PCIC med mCherry reporter, Fig. 4.). Om electroporated retinae undersöks 24 tim efter transfektion, observerar vi att de flesta mCherry ⁺ celler finns i det yttre neuroblast lagret (onbl), där dela stamceller finns, och inte i näthinnans ganglion cellager (gcl, infälld bild), där postmitotic celler lokalisera.

Figur 1. Introduktion till i livmodern elektroporering set-up och metodik. (A) De viktigaste komponenterna i den kirurgiska set-up ingår ett Eppendorf Femtojet microinjector (1), Narishige mikromanipulator med nål hållare (2), Leica steromicroscope (3), fiberoptisk belysning systemet (4), ECM 830 Square Wave elektroporation System med elektroder (5) och värmedyna (6). (A) Djuret bedövas med hjälp av en Vaporizer för isofluran bedövningsmedel. (B, B ') Kortfattat, efter anestesi, är livmodern hornen exponerade och DNA blandat med snabba gröna injiceras i den embryonala hjärnan blåsor. En lyckad injektion visualiseras genom att spåra av den snabba gröna färgen (B). (C, C ') Efter att DNA är framgångsrikt injiceras är paddeln elektroder som placeras på vardera sidan av livmodern, positioning embryot så att DNA kommer att dras mot den positiva polen in i hjärnan regionen val. (D, D) När alla önskade embryon injiceras, är livmodern trycks tillbaka in i buken (D), är bukhinnan sys, och huden är häftade (D). Den dräktiga får sedan återhämta sig och electroporated valpar samlas in på den önskade tidpunkter.

Figur 2. Representativt exempel på rygg telencephalic elektroporation. (AC) Photomicrograph en koronalt snitt genom en E13.5 ryggens telencephalon electroporated vid E12.5 med pCIG2. Electroporated GFP ⁺ celler analyseras för deras uttryck av markörer för apikala stamceller (Pax6 ^+, röd, A), basala stamceller (Tbr2 ^+, röd, B) och nervceller postmitotic (Tbr1 ^+, röd, C). cp, kortikala plattan, SVZ, subventrikulära zonen, VZ, ventrikulär zon.

Figur 3. Representativt exempel på diencephalic elektroporation. (A) En ventrala syn på en E14 hjärnan som har electroporated på E12 med pCIG2. GFP epifluorescence är synlig i thalamus, pre-thalamus och hypothalamus, som visar spridningen av idag injiceras pCIG2 plasmiden hela 3: ^e ventrikeln. (B) Photomicrograph av koronalt snitt genom electroporated hjärnan, visar migration av GFP ⁺ celler ur ventrikulära zonen och in i manteln zon, där hypotalamus kärnor kommer att bilda. 3V, tredje ventrikeln, T, thalamus, Hy, hypothalamus, MZ, mantel zon, Tel, telencephalon, Pret, prethalamus, VZ, ventrikulär zon.

Figur 4. Representativt exempel på näthinnan elektroporation. Coronal snitt genom en E16.5 öga electroporated med PCIC vid E15.5 visar en ansamling av mCherry + celler i det yttre neuroblast lagret och inte i Brn3b ⁺ retinal ganglion celler i ganglion cellager. Den infällda bilden är en högre förstoring bild av den inramade området. GCL, retinal ganglion cellager, le, lins, onbl, yttre neuroblast lagret, Re, näthinnan.

I livmodern elektroporation kan användas för att analysera en mängd olika utvecklingsprocesser. Till exempel kan transfektion av reporter gener som GFP, mCherry eller alkaliska fosfataser tillgripas för att genomföra härstamning spårning och neuronala experiment migration. Alternativt kan Cre recombinase vara tillfälligt uttryck för att selektivt eliminera en floxed allel hos ett rumsligt-och / eller tidsmässigt-kontrollerat sätt. Dessutom kan shRNA eller dominerande negativa konstruktioner vara electroporated att ÖVERVÄLDIGANDE målgenen funktion. Slutligen kan riktas överuttryck eller misexpression av viktiga gener i både vildtyp och / eller genetiskt mutant linjer mus användas för att studera beslut cell öde. Den höga genomströmningen av denna analys är avgörande eftersom det ger för att testa många kombinationer av faktorer i en mycket kort tid. Ett varningens är att detta förfarande orsakar förändringar i genuttryck i celler som klär nålen posten webbplatsen (dvs, skada-svar gener uppregleras i såret, som observerats av oss och andra ^13). Det rekommenderas därför att fokusera på electroporated celler utanför såret. Dessutom embryonala överlevnad är låg när de lär sig den här tekniken men snabbt ökar till> 95% med praktik. Hittills har vi använt med framgång i livmodern elektroporering teknik för att identifiera gener som regleras av proneural faktorer bHLH transkription i telencephalon ^4. Vi har även validerat användningen av denna teknik för analys av telencephalic cis-reglerande element ^3.