Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

1. Set-up

1. Set-up área cirúrgica, como mostrado na figura. 1A, A '. Componentes-chave do set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor, Narishige micromanipulador com porta-agulha, steromicroscope Leica, sistema de fibra ótica de iluminação, 830 ECM Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos, almofada de aquecimento e um vaporizador de anestésico isoflurano.
2. Limpe todas as ferramentas com um líquido de limpeza ultra-sônica utilizando Bransonic Metriclean2 solução pouca espuma para sonicando instrumentos cirúrgicos. Esterilizar instrumentos em autoclave. Ferramentas esterilizados são então mantidos em Germex.
3. Prepare seringas com solução salina estéril morna e estéril solução de Ringer Lactato.

2. Anestesia

1. Coloque o animal dentro de um pequeno (12cm x 20cm) anestésico câmara. Usando um vaporizador, entregar 5% anestésico isoflurano e oxigênio em 1l/min (Fig. 1A, A '). Notadamente, é importante recolher escape isoflurano usando um sistema de limpeza.
2. Remover animais da câmara quando a respiração torna-se profunda e regular. Beliscar dedo do pé e os exames oftalmológicos blink reflex são usados ​​para garantir a anestesia total.
3. Lugar do mouse grávidas em suas costas em cima de uma almofada de aquecimento (37 ° C). A almofada de aquecimento é a primeira esterilizadas, limpando com álcool a 70%, e é então coberto com uma gaze esterilizada, sem fiapos. Use um tubo respirador e aparelho de máscara para entregar isoflurano (2,25%) durante a cirurgia.
4. Injetar buprenorfina (0.1mg/Kg peso corporal) por via subcutânea sob a pele na nuca do pescoço.
5. Monitor de animal ao longo da cirurgia para a respiração profunda e regular. O animal não deve gasp, respire superficialmente ou rapidamente. Respiração superficial e rápida pode ser um sinal de luz anestesia, eo fluxo de isoflurano deve ser aumentada. Se o animal começa a ofegar, reduzir o fluxo de isoflurano. No caso de uma parada respiratória, desligue o isoflurano, e aumentar o fluxo de oxigênio até que animal se recuperar. Reinicie o isoflurano em menor concentração.

3. Preparação de animais para a cirurgia

1. Tape forelimbs de animal para a almofada de aquecimento e verifique novamente para uma resposta retração apertando o pé hind com uma pinça sem corte.
2. Usando um cotonete estéril, espalhe uma camada grossa de creme depilatório (ie, Nair) sobre o abdômen. Em traços firmes, garantir a underfur é completamente revestido. Deixe por uma média de três minutos, verificando de forma intermitente, com uma zaragatoa limpa para remoção de pêlos. Umedeça um chumaço de gaze estéril com água estéril e limpe o abdômen até que todos os vestígios desapareceram. Repita com clorexidina na pele (ou seja, Stanhexidine) mais limpo e mais água. Seque o abdômen com uma gaze limpa e esterilizada.
3. Esterilizar local da incisão com clorexidina (ie, Stanhexidine), seguido de mais água estéril. Seque o abdômen com uma gaze limpa e esterilizada. Repita este passo com etanol 70% e um fresco, cotonete esterilizado.
4. Coloque uma gaze esterilizada sobre o abdômen com uma fenda no meio através do qual o cornos uterinos será puxado durante a cirurgia.

4. Incisão e exposição dos cornos uterinos

1. Para expor os cornos uterinos, primeiro localize a linha alba como a linha tênue sob a pele na linha média. Utilizando uma pinça, puxar a pele para longe da parede abdominal e cortar uma incisão pequena, em linha reta do baixo abdômen mid-pele com uma tesoura (aproximadamente 1 cm de comprimento).
2. Utilizando uma pinça e tesouras curvas, repita o processo com o peritônio.
3. Coloque uma gaze estéril com uma pequena fenda vertical sobre incisão e umedecer com solução salina estéril aquecida.
4. Deslize pinça na incisão e localize o útero. Segure incisão aberta com uma pinça, removendo os cornos uterinos.
5. Cuidadosamente compreender o útero entre os embriões primeiro e segundo visível e puxar os embriões para a gaze. Remova ambos os lados dos cornos uterinos, colocando sobre a gaze estéril e contar o número de embriões, anotando todas as reabsorções ou "não saudáveis" (por exemplo, menor tamanho do corpo) embriões. Molhe a cornos uterinos com solução salina e cuidadosamente retorno metade do útero no abdômen.

5. Injeção de DNA em Ventrículos

1. Agulhas cirúrgicas são preparados com uma Puller Micropipeta Sutter Flaming usando micropipetas borosilicato com capilares (Programa: calor = 750, Pull = 30, Vel = 90 tempo, = 150). Usando uma lâmina de bisturi estéril, a ponta da agulha é levemente raspado em um ângulo de 45 graus.
2. Para carregar a agulha, pipetas Pasteur são puxados para um diâmetro estreita sob uma chama. Um pedaço da boca está ligado à pipeta de carregamento para elaborar ~ mL 10 de DNA endotoxina livre de 3mg/ml misturado com 0,01% verde de metila (nota: corante verde de metila permite injeções de DNA a ser visualizada). A agulha é então enchido montado em um suporte micromanipulador e anexado ao injector FemtoJet.
3. Começando com o embrião mais próxima do ovário, circular forcepssão usadas para girar delicadamente o embrião dentro do decidua para que ele seja posicionado "face-forward", permitindo que as injeções de ocorrer em um rostral à direção caudal. Uma fonte de luz de fibra óptica para a iluminação é usada para ajudar a visualizar a linha média do cérebro embrionário, que é ladeado pelos ventrículos laterais grandes em regiões rostral (Fig. 1B, B ').
4. O embrião é mantido em posição com a pinça circular. A agulha é posicionada acima do útero de modo que o ângulo de entrada no cérebro é de aproximadamente 45 graus. Usando o micromanipulador, e um movimento rápido e constante, a ponta da agulha é inserido através da parede uterina e no ventrículo lateral do embrião. Injeções são direcionados para os ventrículos laterais, terceiro ventrículo ou espaço sub-retiniano para atingir o telencéfalo diencéfalo e retina, respectivamente. Note-se que as vesículas cerebrais embrionárias são abertas ao início estágios embrionários de tal forma que o DNA injetado na ventrículos laterais fluirá para o ventrículo 3 ^º.
5. Pressione o pedal para injetar endotoxina livre de DNA (1-3 mL) usando um Eppendorf FemtoJet microinjetor. A injeção de sucesso é facilmente visualizado por difusão do corante verde de metila ao longo dos ventrículos do cérebro embrionário. A agulha é então lentamente removidas por desenho back up para evitar a ruptura.

6. Eletroporação

1. O embrião injetado (ainda dentro do útero) é colocada sobre a gaze esterilizada recobre o abdômen da mãe e molhado abundantemente com soro fisiológico aquecido. Por favor, note ** A adição de solução salina na superfície da membrana é essencial para permitir a passagem eficiente de uma corrente elétrica.
2. GenePaddle eletrodos são usados ​​para segurar o útero após a injeção de DNA. Cinco quadrados pulsos elétricos de 40-50V e 50 ms são entregues a uma taxa de um pulso por segundo usando um sistema de eletroporação ECM8300 BTX (Fig. 1C, C ').
3. Cobrir o embrião injetado / electroporated com gaze molhada de proteção e continuar para o embrião seguinte.
4. Após a conclusão da injeção / eletroporação de todos os embriões desejada, empurre cuidadosamente a cornos uterinos de volta para o abdome (Fig. 1D).
5. Remova cuidadosamente o outro chifre uterine e começar de novo com o embrião mais próximo do ovário.

7. Sutura e grampeamento

1. Uma vez que todos os embriões estão de volta dentro do útero, adicione à cavidade abdominal ~ 2-3 ml de soro quente.
2. Para fechar a ferida, comece removendo a gaze no abdome e identificar os lados do peritônio. Começar a sutura do peritônio usando a linha de seda preta trançada. Não é recomendado o uso de sutura absorvível para este procedimento, uma vez que é tipicamente mais fraco e pode levar a hemorragia pós-cirúrgica e infecção. Ancorar a linha no peritônio próximo ao esterno e vá para longe do ponto de âncora. Certifique-se todas as suturas são apertadas, e que nenhum órgão de base ou de pele tem sido, inadvertidamente, costurada na peritônio. Clipe da linha de sutura remanescentes e descarte.
3. Puxe a pele fechada sobre a linha de sutura com uma pinça. Usando 9 milímetros Reflex ™ pele fechamento grampos, clip da pele sobre a ferida, tomando cuidado para não grampear o debaixo da linha de sutura, ou para puxar a pele com muita força. O método preferido é manter a pele para cima e longe do corpo com uma pinça, e vêm em um ângulo de 90 graus com a ferramenta do grampo. Continue até ferida é fechada (cerca de três grampos). Uma vez terminado, certifique-se grampos estão bem apertados pressionando suavemente junto com a ferramenta de sutura (Figura 1D).

8. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Para monitorar a recuperação anestésica, por sua vez feminina em seu estômago e desligar o isoflurano. Mantendo a face do animal dentro do aparelho de respiração, por sua vez de oxigênio até 3% para ajudar a recuperação da anestesia. O animal deve ser colocado em uma gaze limpa e seca em cima da almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.
2. Enquanto o animal está grogue, injetar 2 mL da solução de Ringer via subcutânea, sob a pele do animal no pescoço.
3. Continue segurando o animal sob fluxo de oxigênio por vários minutos e compressas de gaze aquecimento, a fim de despertar o animal. Ciclos curtos de movimento do animal deve ser observado como ele retorna a um padrão de respiração normal. Observe por alguns minutos até animal parece consciente e acordado.
4. Pulverizador abdômen da fêmea com Gentamicina spray e enrole o animal em uma gaze esterilizada.
5. Transferência do animal em uma gaiola estéril com cama autoclavado e habitação de papelão.
6. Garrafas de água devem ser cuidadosamente limpos, esterilizados e preenchido com água estéril. A 500 mL de água adicionar 2 mL de antibiótico sulfametazina (25% de ações).
7. Administrar a buprenorfina 0,05 mg / kg por via subcutânea após a cirurgia pela manhã.
8. Monitorar de perto a fêmea durante as primeiras 24 horas pós-cirurgia. Se os animais são mantidos mais de 24 horas, as fêmeas são transferidas para novo stergaiolas ile no dia 2.

9. Resultados representante

Neocórtex

O neocórtex é a região do sistema nervoso central que é responsável pelo visual e processamento sensório-motor e maior funcionamento cognitivo. É composto por neurônios de projeção glutamatérgica e GABAérgica interneurônios que são derivados do telencéfalo dorsal e ventral, respectivamente. Para lidar com os papéis de genes diferentes no desenvolvimento neocortical, que usamos em eletroporação utero, quer misexpress ou bloquear a expressão (ou seja, através da utilização de shRNA construções) de genes diferentes na telencéfalo dorsal ou ventral ^1,3,4. Para misexpress genes no telencéfalo de embriões, nós usamos um vetor de expressão bicistronic (pCIG2), contendo um promotor CMV-βactin-enhancer e um local de entrada interna ribossomo (IRES) avançada proteína fluorescente verde (EGFP, em pCIG2) cassete, permitindo transfectadas células para ser detectada por epifluorescência (Fig. 2A-C). Nós usamos essa tecnologia para introduzir construções expressão no telencéfalo de E11.5 a E15.5 (dados apresentados está em E12.5;. Fig. 2). Ao permitir que os embriões a desenvolver vários dias pós-eletroporação, somos capazes de controlar a diferenciação e migração de GFP-rotulados progenitores. À medida que o de diferenciação, 3 dias após a eletroporação-GFP ⁺ células se diferenciam e migram para fora da zona ventricular (vz), zona subventricular (SVZ) e zona intermediária (iz) e na placa cortical (cp;. Fig 2C). Se cérebros electroporated na E12.5 são analisados ​​após 24 horas, podemos monitorar eventos no início da maturação e migração neuronal progenitor por co-rotulagem com marcadores de células progenitoras apical (ie, Pax6;. Fig. 2A), progenitores basal (ie, Tbr2; . Fig. 2B) e pós-mitóticos neurônios neocorticais (ie, Tbr1;. Fig 2C).

Diencéfalo

O hipotálamo está na base ventral do SNC e funciona como um gateway entre os sistemas endócrino e sistema nervoso autônomo. Durante o desenvolvimento, a múltiplos núcleos que compõem o hipotálamo madura diferenciar de uma zona progenitor comum que as linhas da região ventral-a maior parte do diencéfalo embrionárias. Atualmente, as vias moleculares que regulam a proliferação de células progenitoras, diferenciação neuronal ea formação de núcleos hipotalâmicos são mal compreendidos. Usamos eletroporação in utero para atingir a expressão do gene repórter para o diencéfalo embrionárias através da injeção de DNA para o 3 ^º ventrículo de E12 embryos.We seguido da distribuição de GFP na diferenciação de neurônios no E14. Com esta metodologia, conseguimos alvo expressão GFP para o tálamo, pré-tálamo eo hipotálamo (Fig. 3A). Análise de cortes coronais revela que conseguimos alvo expressão GFP para células progenitoras que zona da linha do ventrículo do 3 ^º ventrículo e neurônios que migram para fora da zona do manto para formar núcleos (Fig. 3B)

Retina

A retina é a camada neural do olho, responsável pela conversão de fótons de luz em impulsos elétricos transmitidos ao cérebro. Se desenvolve como um outpocketing do diencéfalo embrionárias e, portanto, é derivado do tubo neural. A retina neural desenvolve a partir de um compartimento progenitor apical que se encontra adjacente ao espaço sub-retiniano, uma cavidade que separa os olhos do mesênquima cabeça. Segmentação construções de DNA para progenitores da retina, portanto, requer que as injeções são feitas em uma área-alvo de pequeno porte. Usando micromanipuladores, conseguimos com sucesso alvo desta pequena área em embriões de E13.5 a E15.5 (mostrado é E15.5 electroporations de PCIC com o repórter mCherry; Fig. 4.). Se retinae electroporated são examinados 24 horas pós-transfecção, observamos que a maioria das células ⁺ mCherry estão localizadas na camada externa neuroblastos (onbl), onde estão localizados dividindo progenitores, e não na camada de células ganglionares da retina (GCL; imagem ampliada), onde as células pós-mitóticas localizar.

Figura 1. Introdução à eletroporação in utero set-up e metodologia. (A) Os principais componentes do cirúrgica set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor (1), Narishige micromanipulador com suporte da agulha (2), Leica steromicroscope (3), fibra ótica de iluminação sistema (4), ECM 830 Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos (5) e almofada de aquecimento (6). (A ') O animal é anestesiado com um vaporizador de anestésico isoflurano. (B, B ') Resumidamente, após a anestesia, os cornos uterinos estão expostos e DNA misturado com verde rápido é injetado no cérebro vesículas embrionárias. A injeção de sucesso é visualizado através do rastreamento do jejum verde corante (B '). (C, C ') Depois que o DNA é injetado com sucesso, os eletrodos são colocados pá de cada lado do útero, positioning o embrião para que o DNA será puxado em direção ao pólo positivo para a região do cérebro de escolha. (D, D ') Uma vez que todos os embriões são injetados desejado, o útero é empurrado de volta para o abdômen (D), o peritônio é suturada, ea pele é grampeado (D'). A fêmea grávida é então tempo para se recuperar e os filhotes electroporated são coletados nos pontos de tempo desejado.

Figura 2. Exemplo representativo de eletroporação telencefálico dorsal. (AC) Fotomicrografia de uma secção coronal através de um telencéfalo dorsal E13.5 electroporated em E12.5 com pCIG2. Electroporated células GFP ⁺ são analisados ​​para a sua expressão de marcadores de células progenitoras apical (Pax6 ^+, vermelho, A), progenitores basal (Tbr2 ^+, vermelho, B) e neurônios pós-mitóticos (Tbr1 ^+, vermelho, C). placas, cp cortical; SVZ, zona subventricular, vz; zona ventricular.

Figura 3. Exemplo representativo de eletroporação diencefálica. (A) Uma visão de um ventral do cérebro E14 que tem sido electroporated no E12 com pCIG2. GFP epifluorescência é visível no tálamo, pré-tálamo eo hipotálamo, demonstrando a propagação do plasmídeo pCIG2 microinjeção ao longo do 3 ^º ventrículo. (B) Fotomicrografia de secção coronal através do cérebro electroporated, mostrando a migração de células GFP ⁺ fora da zona ventricular e na zona do manto, onde núcleos hipotalâmicos irá se formar. 3V ventrículo, em terceiro lugar; T, tálamo; Hy, hipotálamo; mz, manto zona; Tel, telencéfalo; Pret, prethalamus; vz, zona ventricular.

Figura 4. Exemplo representativo de eletroporação da retina. Secção coronal através de um olho E16.5 electroporated com PCIC na E15.5 mostrando o acúmulo de células mCherry + na camada de neuroblastos exterior e não no Brn3b ⁺ células ganglionares da retina na camada de células ganglionares. A inserção é uma imagem de maior ampliação da área de box. GCL, camada de células ganglionares da retina; le, lente; onbl, camada neuroblasto exterior; re, retina.

Eletroporação in utero pode ser usado para analisar uma ampla variedade de processos de desenvolvimento. Por exemplo, a transfecção de genes repórter, como GFP, mCherry ou fosfatase alcalina pode ser usado para conduzir linhagem rastreamento e experiências de migração neuronal. Alternativamente, Cre recombinase pode ser transitoriamente expressa seletivamente eliminar um alelo floxed em um espacialmente e / ou temporalmente controlada maneira. Além disso, shRNA ou dominante constrói negativo pode ser electroporated para knockdown função do gene alvo. Finalmente, a superexpressão alvo ou misexpression de genes-chave, tanto do tipo selvagem e / ou linhas de camundongos geneticamente mutante pode ser usado para estudar decisões destino da célula. A alta taxa de transferência deste ensaio é fundamental, pois permite o teste de muitas combinações de fatores em um tempo muito curto. Uma nota de cautela é que este procedimento não causa mudanças na expressão genética em células que revestem o local de entrada da agulha (ou seja, lesão-resposta genes upregulated na ferida; como observado por nós e os outros ^13). É, portanto, recomenda-se concentrar em células electroporated fora do local da ferida. Além disso, as taxas de sobrevivência embrionária são baixos quando primeiro aprender esta técnica, mas rapidamente origem a> 95% com a prática. Até o momento, temos utilizado com sucesso em tecnologias eletroporação utero para identificar genes regulados por fatores de transcrição bHLH Proneural no telencéfalo ^4. Temos também validou o uso desta técnica para a análise de telencefálico cis-regulatórias elementos ^3.