Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

1. La extracción de RNA a partir de grandes volúmenes de plasma

Una visión general de la prueba de copia única (SCA) y el único protocolo de secuenciación del genoma (SGS) se proporcionan en las Figuras 1 y 2.

1. Para obtener 7 ml de plasma, giro de aproximadamente 14 ml de sangre recogidas en 15 ml de EDTA (no heparina) en tubos de recogida de 2.600 g durante 15 minutos sin freno. Pipeta de plasma (asegurándose de evitar la capa leucocitaria) en tubos de 15 ml.
2. Si el ARN se extrae para el ensayo de copia única (SCA), pico del plasma con 30.000 copias del control del virus del sarcoma de Rous virión interna (RCA). El virus RCAS se prepara antes de realizar la SCA como se describió previamente (20). En pocas palabras, el virus RCAS de sobrenadante de cultivo celular se cuantifica la actividad RT, se diluye a una concentración final de 30 000 viriones por 200 ul, se diluye en los medios de cultivo de tejidos RPMI con FBS al 5%, y se almacenan a -80 ° C en alícuotas de un solo uso. El virus RCAS no debe ser congelado / descongelado antes de su uso en el ensayo. RCAS se enriquece en el plasma del paciente para controlar la eficiencia de la extracción de RNA y de la exactitud de la cuantificación de PCR. Más información acerca de RCAS se puede encontrar en el siguiente enlace: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
3. "Pre-spin" de plasma, en 15 ml tubos de centrífuga cónicos, a 2.600 xg durante 15 minutos para separar los lípidos y restos celulares, que pueden interferir con la correcta cuantificación del ARN.
4. Seton etiqueta fácil-Seal tubos de centrífuga con un marcador permanente para identificar el número de muestra y el lugar donde el sedimento se forma en el tubo. Después de la vuelta anterior, la transferencia de plasma a un tubo de centrífuga Seton fácil-Seal pipeteando el plasma y evitar los desechos celulares y / o lípidos en la superficie. Registre el volumen de entrada de plasma.
5. Añadir Tris-buffer salino (TBS) para llenar el volumen restante del tubo Sello Seton-Fácil de la parte inferior del cuello roscado. Asegúrese de que no queden burbujas están presentes en el tubo o el tubo se derrumbará en la ultracentrífuga. Asegúrese de que la marca de los tubos mirando hacia el exterior al colocar los tubos en el rotor.
6. Sellar con tapones reutilizables y las muestras en un lugar pre-enfriado Sorval T1270 rotor y centrifugar en la ultracentrífuga Sorval 90SE a 170.000 xg (50.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min.
7. Después de la centrifugación eliminar el sobrenadante y añadir 90 ul de agua de grado molecular y 10 ul de proteinasa-K (20 mg / ml) a la pastilla viral (no será visible).
8. Colocar los tubos en un baño de agua a 55 ° C e incubar durante 30 minutos. Asegúrese de que los tubos son colocados en un ángulo de manera que el lado con el pellet se sumerge en la mezcla de proteinasa-K y el agua.
9. Después de la incubación, poco girar el tubo en una centrífuga de mesa para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo (aproximadamente 5 segundos) y añadir 315 ul de la solución de tiocianato de guanidinio 6M y 10 ul de 20 mg / ml de glucógeno (Nota: Siga adecuada guías para el descarte de este material peligroso, no se mezclan con lejía o ácidos y disponer en un recipiente aparte).
10. Vortex ligeramente y girar en breve (de unos 5 segundos). Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego transferir el contenido de cada tubo a una nueva etiqueta tubos de centrífuga de 1,5 ml RNasa libre.
11. Añadir 495 ul de alcohol isopropílico de grado molecular a cada tubo y agitar durante 10 segundos y centrifugar a 21.000 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente.
12. Desechar el sobrenadante y añadir 500 l de etanol al 70%.
13. Vortex durante 10 segundos y centrifugar a 21.000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el etanol con una pipeta de transferencia. Girar de nuevo y eliminar cualquier residuo de etanol con una pipeta. Deje secar al aire durante 10 minutos. (Para el protocolo SGS disolver ARN en 40 ul de 5 mM Tris-HCl pH 8,0, y continuar con el protocolo de SGS).
14. Disolver el pellet en 55 ul de ARN-buffer. ARN-buffer se obtiene mediante la adición de 10 ul de la TDT en 100 mM y 25 ul de 40 U / ul RNasin a 965 ul de Tris-HCl (pH 8,0, 5 mM). Coloque sobre hielo.

2. El ensayo de copia única

Una placa de 96 pozos con capacidad para 8 muestras de los pacientes incluidos el VIH y las normas RCAS y controles. Este protocolo se describe la puesta en marcha de una sola placa.

1. Comience por la preparación de 2 alícuotas de 1 ml de ARN-buffer en el que el ARN del VIH-1 y las transcripciones de ARN RCAS se diluye por las curvas de nivel de ARN. ARN-buffer se describe en 1.13.
2. Preparar las diluciones en hielo en tubos de 2 ml de centrífuga. Hacer registro medio-diluciones del VIH-1 ARN transcritos de ARN-buffer mediante la adición de 25 ul de la población de ARN VIH-1 (1x10 ⁶ copias / ul) a 54 ul de ARN-buffer dando 3x10 ⁵ copias / ul.
3. Continuar el proceso de registro consecutivos medio diluciones (25 + 54 ul ul) a partir de 0,3 copias por 10 ul (Nota: 0,3, 1 y 3 diluciones, no será parte de la curva estándar durante el análisis de éstos se utilizan como valores de la extrapolación y se debe establecer durante incógnitasanálisis de ING). Transcripciones RCAS se siembran a 1x10 ⁶ copias / ul. Del mismo modo, preparar registro medio-diluciones de las transcripciones de ARN en RCAS-buffer, pero a 100 copias por 10 ul.
4. Preparar el cóctel de RT para la síntesis de cDNA como se indica en la Tabla 1. Prepare RT y reacciones NRT como se indica en la Tabla 1, teniendo en cuenta para hacer un poco más para tener en cuenta cualquier pérdida que pueda ocurrir durante la transferencia. Nota: para el cóctel de NRT, la enzima RT se sustituye por agua para el control de la amplificación de ADN.
   Nota: Este paso ha sido recientemente automatizado, además de la placa configurada en un robot Qiagen (originalmente Corbett).
5. Configure la óptica de 96 pocillos (como se muestra en la Figura 3), mediante la adición de 20 ul de la mezcla de reacción RT a cada pocillo. En los 8 pozos de la etiqueta "NRT", agrega el cóctel sin la transcriptasa inversa (NRT mezcla de reacción). Después de agregar los cócteles a la placa, añadir 10 ul de agua a los pozos con la etiqueta "No hay controles de la plantilla (NTC)". Añadir 10 ul de las transcripciones del VIH a los pozos con la etiqueta "VIH" en concentraciones que se muestran en la Figura 3. Añadir 10 ul de las transcripciones de RCAS a los pozos con la etiqueta "RCAS" en las concentraciones de acuerdo. Añadir 10 ul de la muestra del paciente en los tres pozos adyacentes marcado "Muestra" en el diagrama de la placa. Añadir 10 ul de la muestra eluida a los pozos de la etiqueta "NRT". Agregar 5 ul de la misma muestra y 5 ul de agua a los pozos de la etiqueta "control interno".
6. Sellar la placa y se ejecutan en el termociclador en: 25 ° C durante 15 minutos, 42 ° C durante 40 minutos, 85 ° C durante 10 minutos, 25 º C durante 30 minutos, y 5 ° C mantener.
7. Prepare maestro PCR mezclas de acuerdo a la Tabla 2.
8. Cuando la síntesis de ADNc se haya completado, vaya a un área designada para el uso de cDNA. En este área designada, se añaden 20 ul de la mezcla maestra de PCR en cada pocillo de la placa de cDNA para el VIH y RCAS. Es importante realizar este paso en un área designada para evitar cualquier posible contaminación.
9. Placa de giro, sellado con una cubierta o ABI Roche óptico y cubrir con una manta óptica (manta sólo es necesario para ABI 7700). Ejecutar en Roche 480 o ABI 7700. Condiciones de PCR: 95 ° C durante 10 minutos, luego 45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 min. Análisis por separado es necesario para RCAS y el VIH. Ejemplos de los resultados se muestran en la Figura 4. La pendiente de la curva estándar se verán afectados por una normal distribución de Poisson de bajo número de copias de las transcripciones. A fin de garantizar la pendiente más precisa de la curva estándar, estas normas bajo número de copia (0,3, 1 y 3 copias) se establece como "desconocidos" ^17.

3. Solo la secuenciación del genoma

1. síntesis de ADNc. Agregar 5 ul de 10 mM dNTPs y 5 ul de la 2 mM de genes específicos de imprimación (pol o env) a un pozo en un 96 y placa de PCR (BioRad). Añadir 40 ul de la ARN extraído. Placa de sello.
2. Desnaturalizar el ARN-mezcla en el termociclador a 65 ° C durante 10 min.
3. Mezcle los reactivos para la síntesis de cDNA, que se enumeran en la Tabla 3. Después del paso de desnaturalización, placa, PCR en hielo, agregar el 50 ul de la mezcla de cDNA de cada muestra.
4. Ejecutar la placa de PCR en el termociclador: 45 ° C durante 50 min, 85 ° C durante 10 min a 4 ° C mantener.
5. Primera PCR, 10 ul reacciones. Prepare la mezcla de reacción de PCR en una bandeja de reactivos utilizando los cebadores para la amplificación de la primera ronda del P6-TA o env (reactivos listados en la Tabla 3, primers que figuran en el cuadro 5).
6. Con una pipeta multicanal prescindir de 8,0 ul de la mezcla de PCR de 73 pozos en la placa de 96 pocillos de PCR (70 muestras y 3 controles negativos).
7. Después de la síntesis de ADNc se completa mover la placa de cDNA y PCR que contiene la mezcla de reacción de PCR en un área designada para el uso de cDNA. En el área designada, añadir 40 ul de Tris-HCl pH 8,0 a cada muestra de cDNA con lo que el volumen final de 140 ul. Añadir ul 2.0 de cDNA para cada uno de los pozos 70 y 2,0 l de agua a cada uno de los controles negativos. Sello de placa de PCR. Ejecutar en el termociclador, el programa en la Tabla 4.
8. PCR - 20 ul reacciones. Mezcle los reactivos para la PCR anidada en la bandeja de reactivos (los reactivos listados en la Tabla 3, primers que figuran en el cuadro 5).
9. Añadir 18 ul de la mezcla de PCR anidada a 73 pozos en una placa de 96 pocillos PCR, mediante una pipeta multicanal
10. Diluir primera 01:05 PCR y añadir 2 ul de la primera ronda de PCR para la PCR anidada. Ejecutar la reacción de PCR en el termociclador, en las condiciones que figuran en la Tabla 4.
11. Corra las muestras en un 1% en gel de agarosa. Para asegurarse de que la mayoría de los productos de PCR son el resultado de una sola molécula de cDNA, no más del 30% de los pozos debe ser positiva. El proceso se ha automatizado utilizando el Beckman Coulter Biomek FM robot para cargar el contenido de las placas de PCR de un 1%, 96 pozos de E-gel (Invitrogen). E-geles se ejecutan durante 7 minutos en la E-base. Productos de la secuencia utilizando primers que figuran en el cuadro 5.

4. Los resultados representativos:

SCA:

Todos los controles deben pasar a fin de considerar la medición de ARN VIH-1 correcta. Si un control negativo es positive, la carrera debe tenerse en cuenta debido a una posible contaminación. A fin de controlar las pérdidas de ARN durante la etapa de extracción, por lo menos 50% de la RCAS pinchos en el plasma debe ser recuperado. Si el promedio de RCAS es <15.000 copias, y la muestra no debe descartarse porque una gran cantidad de ARN pudo haber perdido durante la extracción o otras medidas del protocolo. Esto ocurre en aproximadamente el 10% de todas las muestras de los pacientes a prueba probablemente debido a niveles elevados de lípidos en el plasma ^6. La recuperación del virus RCAS se entiende en el control de la calidad de la extracción y la eficiencia de la síntesis de cDNA y amplificación por PCR. No se utiliza para corregir el VIH recuperación ya que el VIH es probablemente vinculado a las inmunoglobulinas y otras proteínas humanas por lo que es ligeramente diferente del virus aislado en cultivo de tejidos. La recuperación de la ARC en nuestro laboratorio fue en promedio de 25.716 + / - 4.057 copias / mezcla de reacción, o alrededor del 95% + / -15% del ARN RCAS agregó ^17. La NRT (no de la transcriptasa inversa) de control se ejecuta en paralelo con el fin de la prueba para la amplificación de ADN. El valor de NRT se resta de cada uno de los VIH-1 ARN valores, entonces se calcula el promedio y si este número es menor que cero (la amplificación de ADN excede la amplificación del ARN), el resultado sería un fracaso y debe ser descartado porque de los riesgos de la amplificación de ADN en lugar de ARN. Si ARN VIH-1 sólo se amplificó a partir de 1 / 3 pozos, una nueva prueba de la muestra se recomienda para asegurar que la amplificación es cierto para la muestra real que se analizaron y no debido a un posible contaminante.

Si todos los controles de paso, el promedio del VIH-1 el número de copias de ARN en plasma se puede calcular.

Ejemplo 1: Si el promedio del VIH-1 el número de copias es cero, el límite de detección se calcula en función del volumen de plasma a analizar. A modo de ejemplo, digamos que 7 ml de plasma se ensayó. La menor cantidad de ARN que podrían haber sido detectados con esta prueba habría sido una copia de uno de los pozos y las copias 0 en los dos otros pozos que da un promedio de 0,33 copias por pozo. El número de copias promedio luego tiene que ser multiplicado por un factor de 5,5 para llegar al número total de copias en la elución de ARN (que es de 10 ul en cada pozo, pero el volumen de elución total fue de 55 ul). El límite inferior de detección es entonces: 5,5 x 0,33 copias dividido por 7 ml = 1,83 / 7 = 0,3 copias / ml. La concentración de ARN VIH-1 en plasma en este ejemplo fue <0,3 copias / ml.

Ejemplo 2: el VIH-1 ARN es detectable. Se extrajo el ARN de 7 ml de plasma. El promedio de número de copias del VIH-1 ARN por tanto, se calcula en 2,0 ejemplares por cada pozo. A continuación, el número de copias promedio por ml de plasma es de 5,5 x 2,0 copias / ml = 1,6 7 del VIH-1 ARN / ml de plasma.

Una hoja de plantilla de Excel para calcular el número de copias puede ser cargado por el sitio web.

SGS:

Si uno de los controles negativos es positivo, el plazo debe tenerse en cuenta debido a una posible contaminación. El número de producto de cada ejecución dependerá de la carga viral en cada muestra y la condición de la muestra. En nuestra experiencia, una gran cantidad de lípidos en el plasma o las células se reduce la posibilidad de obtener los productos. El almacenamiento de las condiciones y la congelación y descongelación previa de la muestra también influyen en la recuperación de la ARN en gran medida. En general, cuando se trabaja con muestras con cargas virales por debajo de 50 copias / ml, el producto (bandas en gel) es de esperar en aproximadamente 1 / 3 -1 / 2 de las muestras procesadas. Dependiendo de los factores antes mencionados, 1-5 bandas por placa debe ser considerado un buen resultado debido a la baja carga viral en estos pacientes.

Tabla 1. Reacción mixtadas para la síntesis de cDNA en el Ensayo de una sola copia.

Tabla 2. PCR Master Mix y los iniciadores de ensayo de una sola copia.

Tabla 1. CDNA y las mezclas de PCR para la secuenciación del genoma individual.

Tabla 4. Termociclador condiciones para el ensayo de secuenciación del genoma individual.

Tabla 5. Cebadores para el ensayo de secuenciación del genoma individual.

Figura 1. Visión general del Genoma de ensayo de secuenciación Singe (SGS).

Figura 2. Vista general del ensayo de copia única (SCA).

Figura 3. Placa de montaje para el ensayo de una sola copia.

Figura 4. Captura de pantalla de la ABI 7700. A. mostrando el VIH-1 ARN curva estándar con muestras de pacientes y B. muestra una curva de RCAS estándar con muestras de pacientes con púas.

VIH-1 en individuos infectados en el tratamiento antirretroviral combinado (TARC) o que, naturalmente, el control de la infección tienen cargas virales muy bajas, por lo general alrededor de 1 copia por mililitro de plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} La carga viral en pacientes con un control natural, a menudo fluctúan alrededor de un conjunto individual de ^{1, 2, 17.} La sensibilidad de los ensayos descritos en este documento depende en gran medida el volumen de entrada de plasma. En general, hemos estado trabajando con 7 ml de plasma, pero los resultados positivos pueden ser obtenidos a partir de pequeñas cantidades de plasma, además, en función de la carga viral en plasma real. El método de extracción de ARN se describe en este documento es una "cerveza de origen", que es mano de obra intensiva. Hemos encontrado que este método de extracción es muy fiable y más eficaz que los actuales kits comerciales para la extracción de RNA. La calidad del plasma es importante para conseguir el producto. Congelación y descongelación previa de plasma o almacenar a temperaturas superiores a 80 grados puede dañar el ARN y reducir las posibilidades de los productos. Un "pre-spin" de plasma también es muy recomendable para separar lípidos, células y otras particularidades que pueden interferir con el ensayo antes de ultracentrifugación.

Varios pasos en los protocolos han sido automatizadas.

El ensayo SCA tiene la ventaja de ser más sensible que otros ensayos ultrasensibles, como por ejemplo el ensayo en tiempo real descrito por Dornadula et al. con un límite inferior de detección de 5,0 copias por ml de plasma 5, la modificación Amplicor ensayo ultrasensible (Roche, Basilea, Suiza) descrito por Havlir et al. 9 detectar a 2,5 copias por ml de plasma y la transcripción de la semi-cuantitativo amplificación mediada (TMA) de ensayo descrito por Hatano et al. ^8, con un límite inferior de detección estimado de 3,5 copias / ml. En comparación con los otros ensayos ultrasensibles ^{5, 8, 9} recuperación de ARN en el ensayo de SCA es supervisado por un virión de patrón interno (RCA) que posee la velocidad de sedimentación mismo que el VIH-1, por lo que actúa como un virus de respaldo para asegurar que todos los virus han sido granulado durante el giro ultracentrifugación y han sufrido el resto del procedimiento de extracción estrictas. Esto también es muy útil para ayudar a eliminar la posibilidad de detección de falsos negativos. El ensayo SCA tiene la ventaja evidente sobre el ensayo TMA ⁸ de estar directamente cuantitativos. Sin embargo, el ensayo de SCA se compara con otros ensayos ultrasensibles de trabajo muy intenso y costoso. Los resultados del ensayo de SCA sólo son fiables si todos los controles internos pasan.

El ensayo de un solo genoma es el estándar de oro para la amplificación de los genomas. Tiene la ventaja sobre la clonación de no ser sometido a un nuevo muestreo si la cantidad de entrada es baja y ¹⁶ no es sesgada por la recombinación PCR presentó ^15. Sin embargo, SGS está limitada por el primer diseño que pueden sesgar los que el VIH-1 se amplifican las poblaciones ^10.

Tanto la SCA y SGS son altamente dependientes del diseño de la cartilla. Ambos ensayos descritos aquí fueron diseñados para amplificar el VIH-1 subtipo B. Debido a la variabilidad en el subtipo B, el producto no se obtiene en aproximadamente el 10% de las muestras debido a la falta de adecuación entre los cebadores y de la plantilla. Sin embargo, ambos ensayos se pueden adaptar fácilmente a otros subtipos o regiones genómicas de diseño de la cartilla y el cambio de la curva estándar.