Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

1. Extração de RNA a partir de grandes volumes de plasma

Uma visão geral do ensaio de cópia única (SCA) eo único seqüenciamento do genoma (SGS) protocolo são fornecidos nas Figuras 1 e 2.

1. Para obter 7 ml de plasma, spin aproximadamente 14 ml de sangue foram coletadas em 15 ml de EDTA (não heparina) tubos de coleta a 2.600 xg por 15 minutos sem travões. Pipeta plasma (certificando-se de evitar a camada de revestimento buffy) em tubos de 15 ml.
2. Se RNA está sendo extraído para o ensaio de cópia única (SCA), pico do plasma com 30 mil cópias do vírus Rous Sarcoma controle virion interna (ACR). O vírus RCAs é preparado antes de realizar SCA, conforme descrito anteriormente (20). Resumidamente, RCAs vírus de sobrenadante de cultura celular é quantificada pela atividade RT, diluído para uma concentração final de 30.000 virions por 200 ul, diluída em meio de cultura RPMI tecido com FBS 5%, e armazenadas a -80 ° C em alíquotas de uso único. O vírus RCAs não devem ser congelados / descongelados antes da sua utilização no ensaio. RCAs é cravado no plasma do paciente para controlar a eficiência da extração de RNA e para a precisão da quantificação do PCR. Mais informações sobre RCAs pode ser encontrado no seguinte link: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
3. "Spin-Pre" plasma, em 15 ml tubos de centrífuga cônico, a 2.600 xg por 15 minutos para separar as lipídeos e restos celulares, que podem interferir com a quantificação do RNA precisas.
4. Rótulo Seton Easy-Seal tubos de centrífuga com um marcador permanente para identificar o número da amostra e o local onde o pellet formarão no tubo. Após o giro pré-, transferência de plasma para um tubo Seton Seal Easy-centrífuga por pipetagem do plasma e evitando quaisquer detritos celulares e / ou lipídios na superfície. Registrar o volume de entrada de plasma.
5. Adicionar Tris-buffered saline (TBS) para preencher o volume restante do tubo Seal Seton-Fácil para o fundo da garganta threaded. Certifique-se que nenhuma bolha estão presentes no tubo ou o tubo entrará em colapso na ultracentrífuga. Certifique-se que a marca nos tubos é virada para fora quando colocar os tubos no rotor.
6. Seal com re-utilizáveis ​​bonés e amostras em um lugar pré-resfriado T1270 rotor Sorval e centrifugar na ultracentrífuga Sorval 90SE em 170.000 xg (50.000 rpm) a 4 ° C por 30 min.
7. Após a centrifugação remover o sobrenadante e adicionar 90 ul de água de grau molecular e 10 ul-proteinase K (20 mg / ml) para o pellet viral (este não será visível).
8. Colocar os tubos no banho-maria a 55 ° C e incubar por 30 minutos. Certifique-se que os tubos são fixados em um ângulo de modo que o lado com o pellet está imerso na mistura de proteinase K e água.
9. Após a incubação, logo girar o tubo em uma centrífuga de mesa para recolher todo o líquido na parte inferior do tubo (cerca de 5 segundos) e adicionar 315 ul da solução de tiocianato guanidinium 6M e 10 ul de 20 de glicogênio mg / ml (Nota: Siga apropriado diretrizes disposição para este material perigoso, não se misturam com lixívia ou ácidos e dispor em recipiente separado).
10. Vortex levemente e gire em breve (de cerca de 5 segundos). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente e depois transferir o conteúdo de cada tubo para um recém-rotulados 1,5 ml RNAse tubos de centrífuga grátis.
11. Adicionar 495 ul de álcool isopropílico grau molecular a cada tubo vortex, por 10 segundos e centrifugar a 21.000 xg por 30 minutos em temperatura ambiente.
12. Elimine o sobrenadante e adicionar 500 ul de etanol 70%.
13. Vortex por 10 segundos e centrifugar a 21.000 xg por 15 minutos em temperatura ambiente. Remover etanol com uma pipeta. Girar novamente e remover quaisquer etanol residual com uma pipeta. Ar seco por 10 minutos. (Para o protocolo SGS dissolver RNA em 40 ul de 5 mM Tris-HCl pH 8,0, e continuar com o protocolo SGS).
14. Dissolver pellet em 55 ul de RNA-buffer. RNA-tampão é obtida pela adição de 10 ul de 100 mM DTT e 25 ul de 40 Rnasin U / ul para 965 ul Tris-HCl (pH 8,0, 5 mM). Colocar no gelo.

2. O ensaio de cópia única

A placa de 96 poços detém 8 amostras de pacientes incluindo HIV e padrões RCAs e controles. Este protocolo irá descrever o set-up de uma única chapa.

1. Comece por preparar duas alíquotas de 1 ml de RNA-buffer no qual o RNA HIV-1 RNA e transcrições RCAs será diluído para as curvas de RNA padrão. RNA-buffer é descrito em 1.13.
2. Preparar diluições no gelo em dois tubos de centrífuga ml. Faça log-meia diluições de transcrições HIV-1 RNA no RNA-buffer adicionando 25 ul do HIV-1 RNA de ações (1x10 ⁶ cópias / ul) a 54 ul RNA-buffer dando 3x10 ⁵ cópias / ul.
3. Continue fazendo consecutivos meia log-diluições (25 + 54 ul ul) até 0,3 cópias por 10 ul (Nota: 0,3, 1 e 3 diluições não será uma parte da curva padrão durante a análise para estes são usados ​​como valores de extrapolação e deve ser definido como dur incógnitasing análise). Transcrições RCAs são estocados em 1x10 ⁶ cópias / ul. Da mesma forma, prepare meia log-diluições de transcrições RCAs no RNA-buffer, mas até 100 cópias por 10 ul.
4. Prepare o coquetel RT para a síntese de cDNA, conforme listado na Tabela 1. Prepare RT e reações NRT conforme listado na Tabela 1 tendo em mente para tornar-se um pouco mais para dar conta por qualquer perda que possa ocorrer durante a transferência. Nota: para o cocktail NRT, a enzima RT é substituída por água para controlar a amplificação de DNA.
   Nota: Esta etapa foi recentemente automatizados, além de placa configurada em um robô Qiagen (originalmente Corbett).
5. Configure a placa de 96 poços ópticos (como mostrado na Figura 3), pela adição de 20 ul da RT mistura de reação a cada poço. Na 8 poços chamado "NRT," adicione o cocktail sem a transcriptase reversa (NRT mistura de reação). Depois de adicionar os coquetéis à placa, adicionar 10 ul de água para poços rotulados como "Sem controles de modelo (NTC)". Adicionar 10 ul de transcrições HIV aos poços rotulados como "HIV" em concentrações mostrado na Figura 3. Adicionar 10 ul de transcrições RCAs de poços chamado "RCAs" em concentrações de acordo. Adicionar 10 ul da amostra do paciente no 3 poços adjacentes rotulados como "amostra" no diagrama da placa. Adicionar 10 ul da amostra eluída aos poços chamado "NRT." Adicionar 5 ul de uma mesma amostra e 5 ul de água aos poços chamado "controle interno".
6. Selar a placa e executado em termociclador em: 25 ° C por 15 minutos, 42 ° C por 40 minutos, 85 ° C por 10 minutos, 25 ° C por 30 minutos, e 5 ° C espera.
7. Prepare mestre PCR mistura de acordo com a Tabela 2.
8. Quando a síntese de cDNA é concluída, se deslocar para uma área designada para a utilização de cDNA. Nesta área designada, adicionar 20 ul da master mix de PCR para cada poço da placa de cDNA para ambos HIV e RCAs. É importante realizar essa etapa em uma área designada para evitar qualquer possível contaminação.
9. Placa de giro, com selo ABI ou Roche capa Optical e cobrir com cobertor óptico (cobertor necessário apenas para ABI 7700). Executado em Roche 480 ou ABI 7700. PCR Condições: 95 ° C por 10 minutos, em seguida, 45 ciclos de 95 ° C por 15 segundos, 60 ° C por 1 min. Análise separada é necessária para RCAs e HIV. Exemplos de resultados são mostrados na Figura 4. A inclinação da curva padrão será afetado por uma distribuição de Poisson normal de transcrições baixo número de cópias. A fim de garantir a inclinação mais precisa para a curva padrão, estas normas baixo número de cópia (0,3, 1 e 3 cópias) são definidas como "incógnitas" ^17.

3. Único Genome Sequencing

1. síntese de cDNA. Adicionar 5 ul de 10 mM dNTPs e 5 ul do 2 mM gene específico primer (pol ou env) para um bem em uma placa de PCR 96 poços (BioRad). Adicionar 40 ul do RNA extraído. Placa de vedação.
2. Desnaturar a RNA-mistura em termociclador a 65 ° C por 10 min.
3. Misturar os reagentes para a síntese de cDNA, listadas na Tabela 3. Após a etapa de desnaturação, coloque a placa PCR em gelo, adicione o ul 50 da mistura de cDNA para cada amostra.
4. Executar PCR placa no termociclador: 45 ° C por 50 min, 85 ° C por 10 min e 4 ° C segurar.
5. Primeira PCR, 10 reações ul. Prepare a mistura de reação de PCR em uma bandeja de reagentes usando os primers para amplificação primeira rodada de p6-rt ou env (reagentes listados na Tabela 3, primers listados na Tabela 5).
6. Com uma pipeta multi-canal de dispensar 8,0 ul de mistura para PCR 73 poços na PCR de 96 poços da placa (70 amostras e 3 controles negativos).
7. Após a síntese de cDNA é completado mover a placa de cDNA e PCR PCR contendo mistura de reacção a uma área designada para a utilização de cDNA. Na área designada, adicionar 40 ul de Tris-HCl pH 8,0 a cada amostra de cDNA elevando o volume final de 140 ul. Adicionar 2,0 ul de cDNA para cada um dos poços 70 e 2,0 ul de água para cada um dos controles negativos. Seal placa PCR. Executado em termociclador, programa na Tabela 4.
8. Nested PCR - Reacções 20ul. Misturar os reagentes para a PCR nested na bandeja de reagentes (reagentes listados na Tabela 3, primers listados na Tabela 5).
9. Adicionar 18 ul da mistura de PCR nested para 73 poços em uma placa PCR de 96 poços, com uma pipeta multicanal
10. Diluir primeira PCR 1:5 e adicionar 2 ul da primeira rodada de PCR para a PCR nested. Executar PCR reação no termociclador, sob as condições listadas na Tabela 4.
11. Executar amostras em um gel de agarose 1%. Para garantir que a maioria dos produtos de PCR são o resultado de uma única molécula de cDNA, não mais que 30% dos poços devem ser positivas. O processo foi automatizado usando o Beckman Coulter Biomek FM robô para carregar o conteúdo das placas PCR de 1%, 96 poços de E-gel (Invitrogen). E-gel são executados por 7 minutos na E-base. Produtos seqüência usando primers listados na Tabela 5.

4. Resultados representativos:

SCA:

Todos os controles devem passar a fim de considerar o HIV-1 RNA medição correta. Se um controle negativo é positive, a corrida deve ser desconsiderada por causa da contaminação possível. A fim de controlar as perdas de RNA durante a etapa de extração, pelo menos, 50% dos RCAs cravado no plasma deve ser recuperado. Se a média é de RCAs <15.000 cópias, a amostra falha e deve ser desconsiderada, pois uma quantidade significativa de RNA poderia ter sido perdidas durante a extração ou outras etapas do protocolo. Isso ocorre em cerca de 10% de todas as amostras de pacientes testados provavelmente devido a elevadas concentrações de gordura no plasma ^6. A recuperação do vírus RCAs serve para controlar a qualidade da extração e da eficiência da síntese de cDNA e amplificação por PCR. Ela não é usada para corrigir HIV recuperação desde o HIV é provavelmente ligados às imunoglobulinas e outras proteínas humanas tornando-o um pouco diferente do vírus isolado de cultura de tecidos. A recuperação da RCA em nosso laboratório foi, em média, 25.716 + / - 4.057 cópias / mistura de reação, ou cerca de 95% + / -15% do RNA RCAs adicionou ^17. A NRT controle (sem transcriptase reversa) é executado em paralelo a fim de testar para a amplificação de DNA. O valor é subtraído do NRT cada um dos três valores HIV-1 RNA, a média é calculada e se este número é inferior a zero (a amplificação do DNA excede a amplificação de RNA), o resultado seria um fracasso e deve ser desconsiderado, pois de risco de amplificação de DNA, em vez de RNA. Se o HIV-1 RNA é apenas amplificado a partir de 1 / 3 poços, re-teste da amostra é recomendado para garantir que a amplificação é verdadeira para a amostra real que está sendo analisada e não devido a um contaminante possível.

Se todos os controles de passagem, a média HIV-1 no número de cópias de RNA no plasma pode ser calculada.

Exemplo 1: Se a média HIV-1 no número de cópias é zero, o limite de detecção é calculado com base no volume de plasma ensaiadas. Como exemplo, digamos 7 ml de plasma foi ensaiada. A menor quantidade de RNA que poderiam ter sido detectados com este ensaio teria sido uma cópia em um dos poços e 0 cópias nos dois outros poços que dá uma média de 0,33 exemplares por bem. O número de cópias média, então tem de ser multiplicada por um fator de 5,5 para chegar ao número total de cópias na eluição RNA (há 10 ul de cada bem, mas o volume de eluição total foi de 55 ul). O limite inferior de detecção é então: 5,5 x 0,33 dividido por cópias 7ml = 1,83 / 7 = 0,3 cópias / ml. A concentração de HIV-1 RNA no plasma neste exemplo foi <0,3 cópias / ml.

Exemplo 2: HIV-1 RNA é detectável. RNA foi extraído de 7 ml de plasma. O número de cópias média de HIV-1 RNA por poço é calculado para ser 2.0 cópias por bem. Em seguida, o número de cópias médio por ml de plasma é de 5,5 x 2,0 cópias / 7 ml = 1,6 HIV-1 RNA / ml de plasma.

Um modelo de folha de Excel usado para calcular números cópia pode ser baixado do site.

SGS:

Se um dos controles negativos é positivo a longo deve ser desconsiderada devido à possível contaminação. O número de produto de cada execução vai depender da carga viral em cada amostra e as condições da amostra. Em nossa experiência um monte de lipídios no plasma ou células irá reduzir a chance de obtenção do produto. Armazenar e condições de congelamento e descongelamento anterior da amostra também influencia a recuperação de RNA muito. Em geral, quando se trabalha com amostras com carga viral abaixo das 50 cópias / ml, produto (bandas em gel) é esperado em cerca de 1 / 3 -1 / 2 das amostras processadas. Dependendo dos fatores acima mencionados, 1-5 bandas por placa deve ser considerado um bom resultado, devido à baixa carga viral nestes pacientes.

Tabela mixt Reação 1.mentos para a síntese de cDNA em Ensaio de cópia única.

Tabela 2. PCR master mix e primers para Ensaio de cópia única.

Tabela 1. CDNA e misturas de PCR para seqüenciamento do genoma único.

Tabela 4. Condições Termociclador para o ensaio único Genome Sequencing.

Tabela 5. Primers para o ensaio único Genome Sequencing.

Figura 1. Visão geral do Ensaio Singe Genome Sequencing (SGS).

Figura 2. Visão geral do Ensaio de cópia única (SCA).

Figura 3. Placa de set-up para o ensaio de cópia única.

Figura 4. Captura de tela da ABI 7700. A. mostrando o HIV-1 RNA curva padrão com as amostras dos doentes e B. mostrando RCAs curva padrão com as amostras do paciente spiked.

HIV-1 indivíduos infectados em tratamento antiretroviral combinada (TARC) ou que naturalmente controlar a infecção têm cargas virais muito baixas, normalmente cerca de 1 cópia por ml de plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Carga viral em pacientes com controle natural, muitas vezes oscilam em torno de um conjunto individual ponto ^{1, 2, 17.} A sensibilidade dos ensaios aqui descritos é altamente dependente do volume de entrada de plasma. Geralmente, temos vindo a trabalhar com 7 ml de plasma, mas os resultados positivos podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de plasma, também, dependendo da carga viral plasmática. O método de extração de RNA aqui descrito é uma "produção caseira", que é de trabalho intensivo. Nós descobrimos que este método de extração é muito confiável e mais eficaz do que as actuais kits disponíveis comercialmente para a extração de RNA. A qualidade do plasma é importante para obter produtos. Congelamento e descongelamento anterior de plasma ou armazenar a temperaturas superiores a -80 graus irá danificar o RNA e reduzir as chances de produto. Um "spin pré-" de plasma também é altamente recomendável para separar os lipídios, células e outras particularidades que possam interferir com o ensaio antes de ultracentrifugação.

Várias etapas nos protocolos foram automatizadas.

O ensaio SCA tem a vantagem de ser mais sensível do que outros ensaios ultra-sensíveis, como por exemplo o ensaio em tempo real descrito por Dornadula et al. com limite inferior de detecção de 5,0 cópias por ml de plasma 5, o Amplicor modificada teste ultra-sensível (Roche, Basel, Suíça), descrito por Havlir et al. 9 detecção para 2,5 cópias por ml de plasma e os semi-quantitativa de transcrição- amplificação mediada ensaio (TMA) descrito por Hatano et al. ^8, com um limite inferior de detecção estimado de 3,5 cópias / ml. Comparação com o outros ensaios ^{ultra-5, 8, 9} de recuperação RNA no ensaio SCA é monitorado por um interno virion padrão (ACR), que possui a mesma taxa de sedimentação de como o HIV-1, assim age como um vírus de backup para garantir que todos os vírus foram peletizadas durante o spin ultracentrifugação e sofreram o restante do procedimento de extração rigorosas. Isso também é muito útil para ajudar a eliminar a possibilidade de detecção de falso negativo. O ensaio SCA tem a vantagem óbvia sobre o ensaio TMA ⁸ de estar diretamente quantitativa. No entanto, o ensaio de SCA é comparado com outros ensaios ultra-sensíveis de trabalho muito intenso e caro. Os resultados do ensaio de SCA só são fiáveis ​​se todos os controles internos passar.

O ensaio de um único genoma é o padrão ouro para a amplificação de genomas. Tem a vantagem sobre a clonagem de não ser submetido a re-amostragem, se a quantidade de entrada é baixa ¹⁶ e não é influenciada por PCR recombinação introduzidos ^15. No entanto SGS é limitado, por projecto cartilha que pode influenciar para qual HIV-1 populações são amplificados ^10.

Tanto a SCA SGS e são altamente dependentes do desenho de primers. Ambos os ensaios aqui descritos foram concebidos para amplificar HIV-1 subtipo B. Devido à variabilidade dentro do subtipo B, o produto não é obtido em cerca de 10% das amostras dos desencontros entre primers e modelo. No entanto, ambos os testes podem ser facilmente adaptadas para outros subtipos ou outras regiões genômicas pelo desenho de primers mudança e da curva padrão.