Amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

1. Extraction d'ARN à partir de grands volumes de plasma

Un aperçu de l'essai à copie unique (SCA) et le single le séquençage du génome (SGS) du protocole sont fournis dans les figures 1 et 2.

1. Pour obtenir 7 ml de plasma, le spin d'environ 14 ml de sang recueilli dans 15 ml d'EDTA (non hépariné) des tubes de prélèvement à 2600 xg pendant 15 minutes sans freinage. Pipeter plasma (en veillant à éviter la couche leuco) dans des tubes de 15 ml.
2. Si l'ARN est extrait pour le dosage à copie unique (SCA), pointe du plasma avec 30 000 copies du contrôle du virus du sarcome de Rous internes du virion (RCAS). Le virus RCAS est préparé avant d'effectuer SCA comme décrit précédemment (20). Brièvement, le virus RCAS à partir du surnageant de culture cellulaire est quantifiée par l'activité RT, diluée à une concentration finale de 30 000 virions par 200 ul, diluée dans les médias RPMI culture tissulaire avec 5% de FBS, et conservés à -80 ° C en aliquotes à usage unique. Le virus RCAS ne doivent pas être congelés / décongelés avant de l'utiliser dans le dosage. EARC est dopé dans le plasma du patient pour contrôler l'efficacité de l'extraction d'ARN et de l'exactitude de la quantification par PCR. Plus d'informations sur EARC peuvent être trouvés à l'adresse suivante: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
3. "Pré-spin" du plasma, dans des tubes de 15 ml à centrifuger conique, à 2600 xg pendant 15 minutes pour séparer les lipides et les débris cellulaires, ce qui peut interférer avec l'ARN quantification précise.
4. Étiquette tubes Seton centrifugeuse Facile-Seal avec un marqueur permanent pour identifier le numéro de l'échantillon et l'endroit où le culot se formera dans le tube. Après le spin pré-transfert de plasma à un des tubes de centrifugation Seton Facile-Seal par pipetage du plasma et en évitant tout débris cellulaires et / ou de lipides à la surface. Noter le volume d'entrée du plasma.
5. Ajouter Tris-solution saline tamponnée (TBS) pour remplir le volume restant du tube Sceau Seton-Facile à bas de la col fileté. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes dans le tube ou le tube va s'effondrer dans les ultracentrifugation. Assurez-vous que la marque sur les tubes est tourné vers l'extérieur lors de la passation des tubes dans le rotor.
6. Sceller avec bouchons réutilisables et des échantillons dans un pré-refroidissement Sorval T1270 rotor et centrifugeuse dans l'ultracentrifugeuse Sorval 90SE à 170 000 xg (50 000 rpm) à 4 ° C pendant 30 min.
7. Après centrifugation retirer le surnageant et ajouter 90 ul d'eau de qualité moléculaire et 10 ul protéinase K (20 mg / ml) au culot viral (ce ne sera pas visible).
8. Placer les tubes dans un bain d'eau à 55 ° C et incuber pendant 30 minutes. Assurez-vous que les tubes sont fixés à un angle de sorte que le côté avec le culot est immergé dans le mélange de protéinase K et d'eau.
9. Après incubation, peu tourner le tube dans une centrifugeuse de table pour recueillir tout le liquide au fond du tube (environ 5 secondes) et ajouter 315 ul d'une solution de thiocyanate de guanidinium 6M et 10 ul de 20 mg / ml de glycogène (Remarque: Suivez appropriée directives d'élimination de ce matériau dangereux; ne pas mélanger avec l'eau de Javel ou d'acides et d'en disposer dans un récipient séparé).
10. Vortex légère et de spin prochainement (pendant environ 5 secondes). Incuber pendant 10 minutes à température ambiante, puis transférer le contenu de chaque tube à une nouvelle tubes étiquetés 1,5 ml RNAse centrifugeuse gratuit.
11. Ajouter 495 ul de la biologie moléculaire alcool isopropylique de qualité à chaque tube, vortex pendant 10 secondes et centrifuger à 21 000 xg pendant 30 minutes à température ambiante.
12. Rejeter le surnageant et ajouter 500 ul d'éthanol à 70%.
13. Vortex pendant 10 secondes et centrifuger à 21 000 xg pendant 15 minutes à température ambiante. Enlever l'éthanol avec une pipette de transfert. Spin encore et enlever tout éthanol résiduel avec une pipette. Sécher à l'air pendant 10 minutes. (Pour le protocole SGS dissoudre l'ARN dans 40 ul de 5 mM de Tris-HCl pH 8,0, et continuer avec le protocole SGS).
14. Dissoudre le culot dans 55 ul d'ARN-tampon. ARN-tampon est obtenue en ajoutant 10 ul de 100 mM de DTT et 25 ul de 40 U / ul Rnasin à 965 ul de Tris-HCl (pH 8,0, 5 mM). Placez-le sur la glace.

2. Le dosage de copie unique

Une plaque de 96 puits détient 8 échantillons de patients, y compris le VIH et les normes EARC et les contrôles. Ce protocole décrit la mise en place d'une plaque unique.

1. Commencez par préparer deux aliquotes de 1 ml d'ARN-tampon dans laquelle l'ARN VIH-1 et EARC transcrits d'ARN sera diluée pour les courbes standard de l'ARN. ARN-tampon est décrite sous 1.13.
2. Préparer des dilutions sur la glace dans deux tubes à centrifuger ml. Faire demi-log des dilutions de transcrits d'ARN VIH-1 dans l'ARN-buffer en ajoutant 25 ul du stock ARN VIH-1 (1x10 ⁶ copies / ul) à 54 ul d'ARN-tampon donnant 3x10 ⁵ copies / ul.
3. Continuer en faisant consécutives demi-log des dilutions (25 + 54 ul ul) à 0,3 exemplaires par 10 ul (Note: 0,3, 1 et 3 dilutions ne sera pas une partie de la courbe standard en cours d'analyse pour ces valeurs sont utilisées comme une extrapolation et devrait être mis à pen inconnuesAnalyse ING). Transcriptions EARC sont stockés à 1x10 ⁶ copies / ul. De même, préparer un demi-log des dilutions de transcriptions EARC dans l'ARN-tampon, mais en baisse à 100 exemplaires par 10 ul.
4. Préparer le cocktail RT pour la synthèse de l'ADNc comme indiqué dans le tableau 1. Préparer la RT et NRT réactions comme indiqué dans le tableau 1 en gardant à l'esprit de faire un petit extra pour rendre compte de toute perte pouvant survenir pendant le transfert. Remarque: pour le cocktail de TSN, l'enzyme RT est remplacé par de l'eau pour contrôler l'amplification de l'ADN.
   Note: Cette étape a récemment été automatisé en plus mis en place la plaque sur un robot Qiagen (à l'origine Corbett).
5. Mettre en place l'optique de plaque de 96 puits (comme le montre la figure 3), en ajoutant 20 ul de mélange réactionnel RT à chaque puits. Dans les 8 puits étiqueté «NRT», ajouter le cocktail sans la transcriptase inverse (mélange réactionnel TRN). Après avoir ajouté les cocktails à l'assiette, ajouter 10 ul d'eau aux puits étiqueté «Aucun contrôle gabarit (NTC)". Ajouter 10 ul de transcriptions du VIH aux puits étiqueté "VIH" dans des concentrations montre la figure 3. Ajouter 10 ul de transcriptions EARC aux puits étiqueté «EARC" dans des concentrations en fonction. Ajouter 10 ul d'échantillon de patient dans les 3 puits adjacents étiquetés «échantillon» sur le schéma de la plaque. Ajouter 10 ul de l'échantillon élué dans les puits étiqueté «NRT». Ajouter 5 ul du même échantillon et 5 ul d'eau pour les puits appelé «contrôle interne».
6. Sceller la plaque et exécuté sur thermocycleur à: 25 ° C pendant 15 minutes, 42 ° C pendant 40 minutes, 85 ° C pendant 10 minutes, 25 ° C pendant 30 minutes, et 5 ° C détiennent.
7. Préparer PCR master mix selon le tableau 2.
8. Lorsque la synthèse de l'ADNc est terminée, passer à une zone désignée pour l'utilisation de l'ADNc. Dans cette zone désignée, ajouter 20 ul du mélange maître PCR dans chaque puits de la plaque d'ADNc pour le VIH et RCA. Il est important d'effectuer cette étape dans une zone désignée pour éviter toute contamination possible.
9. Plaque de Spin, sceller avec couvercle ABI ou Roche optique et couvrir d'une couverture optique (couverture de seulement nécessaire pour ABI 7700). Exécuter sur Roche 480 ou ABI 7700. Conditions de PCR: 95 ° C pendant 10 minutes, puis 45 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes, 60 ° C pendant 1 min. Une analyse distincte est requise pour les CR et le VIH. Des exemples de résultats sont présentés dans la figure 4. La pente de la courbe standard seront touchés par une distribution normale de Poisson de faible nombre de copies des transcriptions. Afin d'assurer la pente le plus précis pour la courbe standard, ces normes peu élevées du nombre de copies (0,3, 1 et 3 copies) sont définis comme «inconnues» ^17.

3. Simple Genome Sequencing

1. synthèse de l'ADNc. Ajouter 5 ul de 10 mM de dNTPs et 5 pi de la mM de 2 gènes amorce spécifique (pol ou env) pour un puits dans un même plaque PCR 96 (Biorad). Ajouter 40 ul de l'ARN extrait. Plaque d'étanchéité.
2. Dénaturer l'ARN-mélange dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 10 min.
3. Mélanger les réactifs pour la synthèse de l'ADNc, énumérés dans le tableau 3. Après l'étape de dénaturation, placer la plaque PCR sur glace, ajouter l'UL 50 du mélange d'ADNc de chaque échantillon.
4. Exécutez la plaque PCR sur thermocycleur: 45 ° C pendant 50 min, 85 ° C pendant 10 min et 4 ° C détiennent.
5. Première PCR, 10 réactions ul. Préparer le mélange réactionnel de PCR dans un plateau de réactifs utilisant soit les amorces pour l'amplification du premier tour p6-rt ou env (réactifs énumérés dans le tableau 3, les amorces énumérées dans le tableau 5).
6. Avec une pipette multi-canaux 8.0 dispenser ul du mélange de PCR à 73 puits sur la plaque de 96 puits de PCR (70 échantillons et 3 contrôles négatifs).
7. Après synthèse de l'ADNc est terminée déplacer la plaque d'ADNc et la PCR contenant mélange de PCR à une zone désignée pour l'utilisation de l'ADNc. Dans la zone désignée, ajouter 40 ul de Tris-HCl pH 8,0 à chaque échantillon d'ADNc portant le volume final à 140 ul. Ajouter 2,0 ul d'ADNc pour chacun des puits 70 et 2,0 ul d'eau pour chacun des contrôles négatifs. Sceau PCR assiette. Exécutez le thermocycleur, programme dans le tableau 4.
8. PCR nichée - réactions 20ul. Mélanger les réactifs pour la PCR nichée dans le plateau des réactifs (réactifs énumérés dans le tableau 3, les amorces énumérées dans le tableau 5).
9. Ajouter 18 ul du mélange de PCR nichée à 73 puits sur une plaque de PCR 96 puits, à la pipette multicanaux
10. Diluer première PCR 01h05 et ajouter 2 ul de la première ronde PCR pour la PCR nichée. Exécuter réaction PCR sur le thermocycleur, dans les conditions énumérées dans le Tableau 4.
11. Exécuter des échantillons sur un gel d'agarose 1%. Afin de s'assurer que la majorité des produits de PCR sont le résultat d'une seule molécule d'ADNc, pas plus de 30% des puits devrait être positive. Le processus a été automatisé en utilisant le Beckman Coulter Biomek FM robot pour charger le contenu des plaques PCR à 1%, 96 puits E-gel (Invitrogen). E-gels sont gérées pendant 7 minutes sur l'E-base. Séquence produits en utilisant des amorces énumérées dans le tableau 5.

4. Les résultats représentatifs:

SCA:

Toutes les commandes doivent passer afin d'examiner la mesure ARN VIH-1 correct. Si un contrôle négatif est positive, la course devrait être écartée pour cause de contamination possible. Afin de contrôler les pertes de l'ARN lors de l'étape d'extraction, au moins 50% de la EARC pointes dans le plasma doit être récupéré. Si la moyenne EARC est <15 000 exemplaires, l'échantillon échoue et devrait être écartée parce qu'une quantité importante de l'ARN pourrait avoir été perdue lors de l'extraction ou à d'autres étapes du protocole. Cela se produit dans environ 10% de tous les échantillons de patients testés probablement en raison de lipides élevé dans le plasma ^6. La récupération du virus RCAS est destiné à contrôler la qualité de l'extraction et l'efficacité de la synthèse de l'ADNc et l'amplification PCR. Il n'est pas utilisé pour corriger le VIH reprise depuis VIH est probablement liée à des immunoglobulines et d'autres protéines humaines qui rend légèrement différente de virus isolé par culture de tissus. La reprise de l'EARC dans notre laboratoire a été en moyenne de 25 716 + / - 4057 copies / mélange réactionnel, soit environ 95% + / -15% de l'ARN EARC ajouté ^17. Le NRT (pas de la transcriptase inverse) de contrôle est exécuté en parallèle afin de tester pour l'amplification de l'ADN. La valeur TRN est soustraite de chacune des trois valeurs d'ARN VIH-1, puis la moyenne est calculée et si ce nombre est inférieur à zéro (l'amplification de l'ADN dépasse l'amplification de l'ARN), le résultat serait échouer et devrait être écartée parce du risque d'amplification de l'ADN plutôt que l'ARN. Si ARN VIH-1 est seulement amplifié à partir de 1 / 3 puits, re-test de l'échantillon est recommandé de s'assurer que l'amplification est vrai pour l'échantillon réel étant analysés et n'est pas due à un contaminant possible.

Si tous les contrôles passent, la moyenne du VIH-1 du nombre de copies d'ARN dans le plasma peut être calculée.

Exemple 1: Si la moyenne du VIH-1 du nombre de copies est à zéro, la limite de détection est calculée en fonction du volume de plasma testé. Par exemple, disons 7 ml de plasma a été dosé. La plus petite quantité d'ARN qui aurait pu être détecté avec ce dosage aurait été une copie dans un des puits et 0 exemplaires dans les deux autres puits qui donne une moyenne de 0,33 copies par puits. Le nombre de copies en moyenne doit ensuite être multiplié par un facteur de 5,5 pour obtenir le nombre de copies au total dans l'élution d'ARN (il ya 10 ul de chaque puits, mais le volume d'élution totale était de 55 ul). La limite inférieure de détection est alors: 5,5 x 0,33 exemplaires divisé par 7ml = 1,83 / 7 = 0,3 copies / ml. La concentration des ARN VIH-1 dans le plasma dans cet exemple est <0,3 copies / ml.

Exemple 2: ARN VIH-1 est détectable. L'ARN a été extrait à partir de 7 ml de plasma. Le nombre de copies en moyenne du VIH-1 par l'ARN est bien calculée à 2,0 copies par puits. Ensuite, le nombre de copies moyen par ml de plasma est de 5,5 x 2,0 copies / 7 ml = 1,6 ARN VIH-1 / ml de plasma.

Une feuille de modèle Excel utilisée pour calculer le nombre de copie peut être téléchargé depuis le site.

SGS:

Si l'un des témoins négatifs est positif, l'exécution doit être négligée en raison de la contamination possible. Le nombre de produits de chaque parcours dépendra de la charge virale dans chaque échantillon et l'état de l'échantillon. Dans notre expérience, beaucoup de lipides ou de cellules dans le plasma va réduire les chances d'obtenir des produits. Les conditions d'entreposage et de congélation et de décongélation précédente de l'échantillon sera également influer sur la reprise de l'ARN grandement. En général, quand on travaille avec des échantillons avec une charge virale inférieure à 50 copies / ml, le produit (bandes sur gel) est à prévoir dans environ 1 / 3 -1 / 2 des échantillons traités. En fonction des facteurs mentionnés ci-dessus, 1-5 bandes par plaque doit être considéré comme un bon résultat en raison de la faible charge virale de ces patients.

Mixt Réaction Tableau 1.res pour la synthèse de l'ADNc dans le dosage à copie unique.

Tableau 2. PCR Master Mix et amorces pour Assay copie unique.

Tableau 1. CDNA et mélanges PCR pour le séquençage du génome unique.

Tableau 4. Thermocycleur conditions pour le dosage de séquençage du génome unique.

Apprêts Tableau 5. Pour le dosage de séquençage du génome unique.

Figure 1. Vue d'ensemble de l'Assay Génome Singe séquençage (SGS).

Figure 2. Vue d'ensemble de l'Assay copie unique (SCA).

Figure 3. Plate set-up pour le dosage à copie unique.

Figure 4. Capture d'écran de l'ABI 7700. A. montrant l'ARN VIH-1 courbe standard avec des échantillons de patients et B. montrant EARC courbe standard avec des échantillons de patients dopés.

VIH-1 des individus infectés sur le traitement antirétroviral (TARV) ou qui, naturellement, le contrôle de l'infection ont une très faible charge virale, généralement autour de 1 exemplaire par ml de plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Charge virale chez les patients avec un contrôle naturel, fluctuent souvent autour d'un jeu individuel, point ^{1, 2, 17.} La sensibilité des tests décrite ici est très dépendante sur le volume d'entrée du plasma. Généralement, nous avons travaillé avec 7 ml de plasma, mais les résultats positifs peuvent être obtenus à partir de petites quantités de plasma, ainsi, en fonction de la charge virale plasmatique réelle. La méthode d'extraction d'ARN décrit ici est un "bière maison" qui est le travail intensif. Nous avons constaté que cette méthode d'extraction est très fiable et plus efficace que les kits existants disponibles dans le commerce pour l'extraction de l'ARN. La qualité du plasma est important d'obtenir des produits. La congélation et la décongélation précédente de plasma ou de stocker à des températures supérieures à -80 degrés endommagera l'ARN et de réduire les chances de produit. Un «pré-spin» de plasma est également fortement recommandé de séparer les lipides, les cellules et d'autres particularités qui peuvent interférer avec le dosage avant d'ultra-centrifugation.

Plusieurs étapes dans les protocoles ont été automatisées.

Le dosage de SCA a l'avantage d'être plus sensibles que d'autres dosages ultrasensibles, comme par exemple le dosage en temps réel décrit par Dornadula et al. avec une limite inférieure de détection de 5,0 copies par ml de plasma 5, la modification Amplicor ultrasensible de dosage (Roche, Bâle, Suisse) décrit par Havlir et al. 9 détecter à 2,5 copies par ml de plasma et le semi-quantitative de transcription- l'amplification médiée (TMA) de dosage décrit par Hatano et al. ⁸ avec une limite inférieure de détection estimées de 3,5 copies / ml. Comparé à d'autres dosages ultrasensibles de la ^{5, 8, 9} de récupération dans le dosage de l'ARN SCA est contrôlée par un virion standard interne (RCAS) qui possède le taux de sédimentation comme le VIH-1, donc il agit comme un virus de sauvegarde pour s'assurer que tous les virus ont été enrobées pendant le spin ultracentrifugation et ont enduré le reste de la procédure d'extraction strictes. C'est aussi très utile pour aider à éliminer la possibilité de détection des faux négatifs. Le dosage de SCA a l'avantage évident sur ​​le dosage de la TMA ⁸ d'être directement quantitative. Cependant, le dosage de la SCA est comparé à d'autres dosages ultrasensibles travail très intense et coûteuse. Les résultats de l'essai de SCA ne sont fiables que si tous les contrôles internes passent.

La seule analyse du génome est l'étalon-or pour l'amplification des génomes. Il a l'avantage sur le clonage de ne pas être soumis à ré-échantillonnage si le montant de l'entrée est faible ¹⁶ et n'est pas biaisée par recombinaison PCR introduit ^15. Cependant SGS est limitée par la conception amorce qui peut biaiser dont le VIH-1 des populations sont amplifiées ^10.

Tant le SCA et SGS sont très dépendants de conception d'amorce. Les deux dosages décrits ici ont été conçus pour amplifier le VIH-1 sous-type B. En raison de la variabilité au sein du sous-type B, le produit n'est pas obtenue dans environ 10% des échantillons en raison de l'inadéquation entre les amorces et modèle. Toutefois, les deux dosages peuvent facilement être adapté à d'autres sous-types ou d'autres régions génomiques par conception d'amorce et de changer la courbe standard.