Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

1. Utvinning av RNA från stora volymer av plasma

En översikt av de exemplar analys (SCA) och det gemensamma genomet sekvensering (SGS) protokoll som finns i figur 1 och 2.

1. För att få 7 ml plasma, snurra ca 14 ml blod samlas i 15 ml EDTA (inte heparin) samling rör vid 2600 xgi 15 minuter utan att bromsa. Pipettera plasman (var noga med att undvika buffy coat lager) till 15 ml rör.
2. Om RNA är extraheras för den inre kopia analys (SCA), Spike plasma med 30.000 exemplar av Rous sarkom Virus intern virionens kontroll (RCAS). Den RCAS Viruset är beredd innan du utför SCA som beskrivits tidigare (20). Kortfattat är RCAS viruset från cellodling supernatant kvantifieras med RT aktivitet, utspätt till en slutlig koncentration av 30.000 virioner per 200 ul, utspädd i RPMI media vävnadsodling med 5% FBS, och förvaras vid -80 ° C i engångsbruk alikvoter. Den RCAS virus bör inte frysas / tinas innan de används i analysen. RCAS är spetsade in i patientens plasma att kontrollera för effektiviteten i RNA-extraktion och för riktigheten av PCR kvantifiering. Mer information om RCAS finns på följande länk: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
3. "Pre-spin" plasma, i 15 ml koniska centrifugrör, vid 2600 xgi 15 minuter för att skilja ut sådana lipider och cellulära skräp som kan störa exakt RNA kvantifiering.
4. Etikett Seton Easy-Seal centrifugrör med en permanent markör för att identifiera provnummer och platsen där kulan kommer att ligga i röret. Efter pre-spin, överföring plasma till en Seton Easy-Seal centrifugrör genom att pipettera av plasma och undvika cellulär skräp och / eller lipider på ytan. Spela ingången volym plasma.
5. Lägg Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) för att fylla återstående volymen av Seton-Easy Seal röret till botten av den gängade halsen. Var noga med att inga bubblor finns i röret eller slangen kommer att kollapsa i ultracentrifugen. Se till att märket på rören är vänd utåt när du placerar i rören i rotorn.
6. Tätning med återanvändbara kepsar och prov plats i en nedkylda Sorval T1270 rotorn och centrifugera i Sorval 90SE ultracentrifugen vid 170.000 xg (50.000 rpm) vid 4 ° C i 30 min.
7. Efter centrifugering bort supernatanten och tillsätt 90 ul molekylär kvalitet vatten och 10 ul proteinas-K (20 mg / ml) till den virala pellet (detta kommer inte att synas).
8. Placera rören i en 55 ° C vattenbad och inkubera i 30 minuter. Se till att rören är inställd på en vinkel så att sidan med pellets är nedsänkt i proteinas-K och vatten-blandning.
9. Efter inkubation, strax snurra röret i en bordsskiva centrifug för att samla in all vätska i botten av röret (ca 5 sekunder) och tillsätt 315 ul av 6M guanidinium tiocyanat lösning och 10 ul av 20 mg / ml glykogen (Obs: Följ lämpliga riktlinjer för disposition för detta farliga material, inte blandar med blekmedel eller syror och släng i separata behållare).
10. Vortex lätt och snurra kort (ca 5 sekunder). Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur och sedan överföra innehållet i varje rör till en nyligen märkt 1,5 ml RNAse gratis centrifugrör.
11. Tillsätt 495 ul av molekylära kvalitet isopropylalkohol till varje rör, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid 21.000 xg under 30 minuter vid rumstemperatur.
12. Kassera supernatanten och tillsätt 500 ul av 70% etanol.
13. Vortexa i 10 sekunder och centrifugera vid 21.000 xg under 15 minuter i rumstemperatur. Ta bort etanol med en överföringspipett. Spin igen och ta bort eventuella etanol med en pipett. Lufttorka i 10 minuter. (För SGS protokollet upplösa RNA i 40 ul av 5 mM Tris-HCl pH 8,0, och fortsätt med SGS-protokollet).
14. Lös upp pelleten i 55 ul av RNA-buffert. RNA-buffert erhålls genom att addera 10 ul av 100 mm DTT och 25 ul av 40 U / ul Rnasin till 965 ul Tris-HCl (pH 8,0, 5 mm). Placera på is.

2. Den enda exemplar analys

En 96-brunnar rymmer 8 patientprover med både hiv och RCAS standarder och kontroller. Detta protokoll kommer att beskriva inrättandet av en enda skylt.

1. Börja med att förbereda 2 portioner om 1 ml RNA-buffert, där HIV-1 RNA och RCAS RNA-transkript kommer att spädas ut för RNA standardkurvor. RNA-buffert beskrivs under 1,13.
2. Förbered spädningar pÃ¥ is i 2 tuber ml centrifugen. Gör halv-log spädningar av HIV-1 RNA-transkript hos RNA-buffert genom att tillsätta 25 ul av HIV-1 RNA lager (1x10 ⁶ kopior / ul) till 54 ul RNA-buffert som ger 3x10 ⁵ kopior / ul.
3. Fortsätt genom att göra varandra halv-log spädningar (25 ul + 54 ul) ner till 0,3 kopior per 10 UL (OBS: 0,3, 1 och 3 spädningar kommer inte att vara en del av standardkurvan under analys av dessa används som extrapolering värden och bör sättas till okända DURning analys). RCAS avskrifter finns i lager i 1x10 ⁶ kopior / ul. LikasÃ¥ förbereda halv-log spädningar av RCAS transkript hos RNA-buffert, men ned till 100 exemplar per 10 ul.
4. Förbered RT cocktail för cDNA syntes som anges i tabell 1. Förbered RT och nikotinläkemedel reaktioner som anges i tabell 1 i åtanke att göra upp lite extra för att stå för någon förlust som kan uppstå under överföringen. Obs: för NRT cocktail är RT enzymet ersättas med vatten för att kontrollera för förstärkning från DNA.
   OBS: Detta steg har nyligen automatiserade förutom att plattan inrättas på Qiagen Robot (ursprungligen Corbett).
5. Ställ in det optiska 96-brunnar (se Figur 3), genom att tillsätta 20 ul av RT reaktionsblandningen i varje brunn. I märkt 8 brunnar "NRT," lägg till cocktail utan omvänt transkriptas (NRT reaktionsblandningen). När du lagt till cocktails till plattan, tillsätt 10 ul av vatten i brunnarna med etiketten "Nej mall kontroller (NTC)". Tillsätt 10 ul av hiv avskrifter i brunnarna med etiketten "hiv" i koncentrationer som visas i figur 3. Tillsätt 10 ul av RCAS avskrifter i brunnarna med etiketten "RCAS" i enlighet koncentrationer. Tillsätt 10 ul av patientprov i 3 intilliggande brunnar märkta "Sample" på tallriken diagram. Tillsätt 10 ul av elueras prov till brunnarna märkt "NRT." Tillsätt 5 ul av samma prov och 5 ul av vatten till brunnar märkt "intern kontroll".
6. Täta plattan och kör på termocykler vid: 25 ° C i 15 minuter, 42 ° C i 40 minuter, 85 ° C i 10 minuter, 25 ° C i 30 minuter, och 5 ° C håller.
7. Förbered PCR huvudmixar enligt tabell 2.
8. När cDNA syntes är klar, flytta till ett område avsett för användning cDNA. På detta särskilt område, tillsätt 20 ul av PCR Master Mix till varje brunn på cDNA plattan för både HIV och RCAS. Det är viktigt att utföra detta steg i ett visst område för att undvika eventuell smittspridning.
9. Snurra tallrik, tätning med ABI eller Roche Optikskydd och täck med optisk filt (filt endast nödvändigt för ABI 7700). Kör pÃ¥ Roche 480 eller ABI 7700. PCR-förhÃ¥llanden: 95 ° C i 10 minuter, därefter 45 cykler av 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C i 1 min. Separat analys krävs för RCAS och hiv. Exempel pÃ¥ resultat visas i Figur 4. Lutningen av standardkurvan kommer att pÃ¥verkas av en normal Poisson fördelning av lÃ¥ga avskrifter Kopiera nummer. För att säkerställa den mest exakta lutning för standardkurvan, dessa lÃ¥gt antal exemplar standarder (0,3, 1 och 3 kopior) är inställda som "okända". ¹⁷

3. Singel genomsekvenseringsprojekt

1. cDNA syntes. Tillsätt 5 ul av 10 mM dNTP och 5 ul av 2 mM genspecifika primer (pol eller env) till en brunn i en 96 väl PCR-plattan (Biorad). Tillsätt 40 ul av den utvunna RNA. Seal plattan.
2. Denaturera RNA-blandningen i termocykler vid 65 ° C i 10 min.
3. Blanda reagens för cDNA syntes, som anges i tabell 3. Efter denaturering steg, placera PCR-platta på is, tillsätt 50 ul av cDNA blandningen till varje prov.
4. Kör PCR-plattan på termocykler: 45 ° C i 50 min, 85 ° C i 10 minuter och 4 ° C håller.
5. Först PCR, 10 ul reaktioner. Bered PCR-reaktionsblandningen i en reagens fack med antingen primers för första omgången amplifiering av P6-rt eller ENV (reagens som anges i tabell 3, primers anges i tabell 5).
6. Med hjälp av en flerkanals pipett dispensera 8,0 ul av PCR-blandning till 73 brunnar på 96 väl PCR-platta (70 prover och tre negativa kontroller).
7. Efter cDNA syntes är klar flytta cDNA och PCR-platta med PCR-reaktionsblandningen till ett område avsett för användning cDNA. I det angivna området, tillsätt 40 ul av Tris-HCl pH 8,0 till varje cDNA prov föra slutliga volymen till 140 ul. Tillsätt 2,0 ul av cDNA till envar av de 70 brunnar och 2,0 ul vatten till var och en av de negativa kontrollerna. Seal PCR-platta. Kör på termocykler, programmet i tabell 4.
8. Nästlade PCR - 20ul reaktioner. Blanda reagenser för den kapslade PCR i reagensen facket (reagenser anges i tabell 3, primers anges i tabell 5).
9. Tillsätt 18 ul av kapslade PCR-blandning till 73 brunnar på en 96 väl PCR-platta, med multikanalpipett
10. Späd first PCR 1:5 och tillsätt 2 ul i första omgången PCR till kapslade PCR. Kör PCR-reaktion på termocykler, på de villkor som anges i tabell 4.
11. Kör prov på en 1% agarosgel. För att säkerställa att majoriteten av PCR-produkter är resultatet av en enda molekyl av cDNA, bör inte mer än 30% av brunnarna vara positivt. Processen har varit automatiseras med hjälp av Beckman Coulter Biomek FM-robot för att ladda innehållet i PCR-plattor till en 1%, 96 brunnar E-gel (Invitrogen). E-geler drivs i 7 minuter på E-base. Sekvens produkter med grundfärg i tabell 5.

4. Representativa resultat:

SCA:

Alla kontroller ska passera för att behandla HIV-1 RNA mätning korrekt. Om en negativ kontroll är positive ska köra lämnas utan avseende på grund av eventuella föroreningar. För att kontrollera för förluster av RNA vid extraktion steg bör minst 50% av RCAS spetsade i plasma återvinnas. Om den genomsnittliga RCAS är <15 tusen exemplar, misslyckas provet och inte borde beaktas, eftersom en betydande del av RNA kunde ha gått förlorade under utvinning eller andra steg i protokollet. Detta sker i cirka 10% av alla patientprover testas sannolikt på grund av höga blodfetter i plasma ^6. Återhämtningen av RCAS viruset är tänkt att styra för kvaliteten på utvinning och effektivitet cDNA syntes och PCR-amplifiering. Det är inte används för att korrigera för HIV återhämtning sedan hiv troligen bunden till immunglobuliner och andra mänskliga proteiner vilket gör det lite annorlunda från virus isolerade från vävnadskultur. Återhämtningen av RCAS i vårt labb var i genomsnitt 25.716 + / - 4057 kopior / reaktionsblandningen, eller ca 95% + / -15% av RCAS RNA lagt ^17. Den NRT (ingen omvänt transkriptas) kontroll parallellt för att testa för amplifiering av DNA. Det NRT värdet subtraheras från varje av de tre HIV-1 RNA värden, då genomsnittet beräknas, och om detta antal är mindre än noll (förstärkning av DNA överstiger förstärkning av RNA), skulle resultatet misslyckas och inte borde beaktas, eftersom av risken för förstärkning från DNA istället för RNA. Om HIV-1 RNA är bara förstärks från 1 / 3 brunnar, förnyade försök provet rekommenderas att se till att förstärkningen är sant för själva provet analyseras och inte på grund av en eventuell förorening.

Om alla kontroller passera, kan den genomsnittliga HIV-1 RNA kopior nummer i plasma beräknas.

Exempel 1: Om den genomsnittliga HIV-1 antal kopior är noll, är detektionsgränsen beräknas baserat på volymen av plasma analyseras. Som ett exempel, låt oss säga 7 ml plasma analyseras. Den minsta mängden RNA som kunde ha upptäckts med denna analys skulle ha varit en kopia i en av brunnarna och 0 exemplar i de två andra brunnar som ger ett genomsnitt på 0,33 exemplar per brunn. Det genomsnittliga antalet exemplar måste sedan multipliceras med en faktor 5,5 för att komma till det totala antal kopior i RNA eluering (det finns 10 ul i varje brunn, men den totala urlakningsvolymen var 55 ul). Den undre gränsen för upptäckt är då: 5,5 x 0,33 kopior dividerat med 7ml = 1,83 / 7 = 0,3 kopior / ml. Koncentrationen av HIV-1 RNA i plasma i det här exemplet var <0,3 kopior / ml.

Exempel 2: HIV-1 RNA kan detekteras. RNA extraherades från 7 ml plasma. Det genomsnittliga Antal kopior av HIV-1 RNA per brunn beräknas till 2,0 kopior per brunn. Kan den genomsnittliga antal kopior per ml plasma är 5,5 x 2,0 kopior / 7 ml = 1,6 HIV-1 RNA / ml plasma.

En mall Excel-ark används för att beräkna antalet kopior kan laddas ner från hemsidan.

SGS:

Om en av de negativa kontrollerna är positiv inför bör beaktas på grund av eventuella föroreningar. Antalet produkt från varje körning kommer att bero på virusnivåer i varje prov och tillståndet av provet. Enligt vår erfarenhet en hel del av lipider eller celler i plasma kan minska chanserna att få produkten. Lagra förhållanden och tidigare frysning och upptining av provet kommer också att påverka återhämtningen av RNA kraftigt. I allmänhet när man arbetar med prover med virusbelastning under 50 kopior / ml, produkten (band på gel) är att vänta i ca 1 / 3 -1 / 2 av den bearbetade prover. Beroende på ovan nämnda faktorer bör 1-5 band per platta anses vara ett bra resultat på grund av den låga virusnivåer hos dessa patienter.

Tabell 1. Reaktion mixtgärder för cDNA syntes i enda exemplar analys.

Tabell 2. PCR Master Mix och grundfärger för enskild kopia analysen.

Tabell 1. CDNA och PCR-blandningar för inre Genome sekvensering.

Tabell 4. Termocykler villkor för inre genomsekvenseringsprojekt analys.

Tabell 5. Grundfärg för inre genomsekvenseringsprojekt analys.

Figur 1. Översikt över Singe genomsekvenseringsprojekt analys (SGS).

Figur 2. Översikt över exemplar analys (SCA).

Figur 3. Tavla set-up för inre Copy-analys.

Figur 4. Skärmdump från ABI 7700. A. visar HIV-1 RNA standardkurva med patientprover och B. visar RCAS standardkurva med spikade patientprover.

HIV-1 infekterade individer på antiretroviral behandling (CART) eller som naturligtvis bekämpa infektionen har mycket låga virusnivåer, vanligen omkring 1 exemplar per ml plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Virusbelastningen hos patienter med naturlig kontroll, ofta fluktuera kring ett enskilt börvärde ^{1, 2, 17.} Känsligheten i analyserna som beskrivs häri är starkt beroende av ingående volym plasma. Generellt har vi arbetat med 7 ml plasma, men positiva resultat kan erhållas från mindre mängder av plasma, liksom, beroende på den faktiska virusmängd i plasma. RNA-extraktion metod som beskrivs här är en "hem brygga" som är arbetsintensiv. Vi har funnit att denna extraktion metod är mycket tillförlitlig och mer verksamt än existerande kommersiellt tillgängliga kit för RNA-extraktion. Kvaliteten på plasma är viktigt att få produkten. Tidigare nedfrysning och upptining av plasma eller lagring vid högre temperaturer än -80 grader skadar RNA och minska risken för produkten. En "pre-spin" av plasma är också starkt rekommenderat att skilja ut lipider, celler och andra uppgifter som kan störa analysen innan ultra-centrifugering.

Flera steg i protokollen har automatiserats.

SCA-analys har fördelen av att vara mer känsliga än andra ultrakänslig analyser, som till exempel i realtid analys beskrivs av Dornadula et al. med en lägre detektionsgräns pÃ¥ 5,0 kopior per ml plasma 5, den modifierade Amplicor ultrakänslig analys (Roche, Basel, Schweiz) beskrivs av Havlir et al. 9 upptäcka ner till 2,5 kopior per ml plasma och semikvantitativ transkription- medierad förstärkning (TMA) analys beskrivs av Hatano et al. ⁸ med en beräknad lägre detektionsgräns pÃ¥ 3,5 kopior / ml. Jämfört med andra ultrakänslig analyser ^{5, 8, 9} RNA Ã¥terhämtning i SCA-analys övervakas av en intern virionens standard (RCAS) som har samma sänkan som HIV-1, vilket fungerar som en backup virus för att säkerställa att alla virus har pelleterat under ultracentrifugering snurra och har uthärdat resten av stränga extraktionsförfarande. Detta är ocksÃ¥ mycket användbart för att eliminera risken för falska negativa upptäckt. SCA-analys har den uppenbara fördelen över TMA-analysen ⁸ av att vara direkt kvantitativa. Men SCA-analysen är jämfört med andra ultrakänslig analyser mycket arbetskraftsintensiv och dyr. Resultat frÃ¥n SCA-analysen är bara tillförlitliga om alla interna kontroller passera.

Den enda genomet analysen är den gyllene standarden för amplifiering av genomet. Det har den fördelen framför kloning av att inte utsättas för ny provtagning om mängden indata är lÃ¥g ¹⁶ och inte är pÃ¥verkade av PCR infördes rekombination ^15. Men SGS begränsas av primer design som kan fördomar som HIV-1-populationer förstärks ^10.

Både SCA och SGS är starkt beroende av primer design. Båda analyserna beskrivs här var avsedda att förstärka hiv-1 subtyp B. På grund av variabilitet inom B subtyp, är produkten inte erhållits i ca 10% av proven på grund av bristande överensstämmelse mellan primers och mall. Men både analyserna enkelt anpassas till andra undergrupper eller andra genomiska regioner genom att ändra primer design och standardkurvan.