मानव islets के मरीजों को आंशिक रूप से Pancreatectomized से अलगाव

Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962, doi:10.3791/2962 (2011).

टाइप 2 मधुमेह और Langerhans ¹ खराबी की islets के रोगजनन में जांच टाइप 2 अंग ² दाताओं से मधुमेह islets की सीमित उपलब्धता द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. यहाँ हम मानव अग्नाशय के टाइप 2 मधुमेह और गैर मधुमेह के रोगियों जो आंशिक pancreatectomy अलग अग्नाशय के रोगों (सौम्य या घातक ट्यूमर अग्नाशय, पुरानी pancreatitis के, और आम पित्त नली या ग्रहणी ट्यूमर) के कारण आया है से प्राप्त ऊतक से अलग islets करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का हिस्सा . सभी शामिल रोगियों इस अध्ययन है, जो भी स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था करने के लिए उनकी सहमति दे दी है. शल्य नमूनों तुरंत रोगविज्ञानी जो आइलेट अलगाव के लिए मुलायम और स्वस्थ दिखने अग्नाशय के ऊतकों को चुना, नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए क्षतिग्रस्त ऊतकों बनाए रखने के लिए दिया गया. हमने पाया है कि 1,000 से अधिक islets अलग के लिए, हम अग्नाशय के ऊतक के कम से कम 2 जी के साथ शुरू किया था. इसके अलावा हमारे प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक दिख ऊतक फैलाना जब एंजाइम युक्त मीडिया इंजेक्शन और बाद में यह कीमा सतह क्षेत्र को बढ़ाने के द्वारा पाचन सहायता के लिए किया गया था.

प्रयोज्यता हमारे प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए कभी कभी मामले में मानव अग्नाशय के ऊतकों की एक बड़ी राशि (15g>) उपलब्ध है शामिल करने के लिए, हम एक Ricordi कक्ष (50 मिलीलीटर) इस्तेमाल करने के लिए ऊतक को पचाने. पाचन के दौरान, हम मैन्युअल रूप से एक तीव्रता है कि ऊतक तंतुमयता के अपने स्तर के अनुसार नमूना ^{द्वारा} विभिन्न पर Ricordi 3 चैम्बर को हिलाकर रख दिया. एक discontinous Ficoll ढाल तो कोष्ठकी ऊतकों से islets अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम ने कहा है कि ऊतक गोली काफी छोटे homogenously 1.125 ग्राम / मिलीलीटर की एक घनत्व के साथ Ficoll मध्यम में resuspended होना चाहिए. अलगाव के बाद, हम कम से कम 48 घंटे के लिए _5% सीओ 2 के साथ तनाव मुक्त (नहीं मिलाते या रोटेशन) 37 ° शर्तों सी के तहत islets के क्रम में उनके कार्यात्मक वसूली की सुविधा के लिए सुसंस्कृत. हमारे प्रोटोकॉल और उसके भविष्य के सुधार के व्यापक आवेदन मधुमेह से मानव islets की एक बड़ी मात्रा के समय पर कटाई और चिकित्सकीय मिलान गैर मधुमेह विषयों सक्षम, बहुत टाइप 2 मधुमेह अनुसंधान अग्रिम कर सकता है.

1. ऑपरेटिंग कमरे में अग्नाशय के ऊतक संग्रह

1. सर्जन अग्न्याशय का एक आंशिक लकीर करता है.
2. एक बॉक्स में बर्फ पर अग्नाशय नमूना रखने के बाद, इसे तुरंत देने रोगविज्ञानी.

2. आइलेट अलगाव के लिए ऊतक चयन

1. रोगविज्ञानी ऊतक कि मुलायम और स्वस्थ प्रतीत होता है का चयन, नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए क्षतिग्रस्त ऊतकों को बनाए रखना है. Fibrotic ऊतक और प्रयोग करने योग्य ऊतक के कम से कम 2 जी की पेशकश नमूनों आइलेट अलगाव से बाहर हैं.
2. यूरो कोलिन्स समाधान में अग्नाशय के ऊतकों को विसर्जित और बर्फ पर प्रयोगशाला में पहुंचा.

3. मानव islets के अलगाव

1. अग्नाशय के ऊतकों का वजन करने के लिए, तो यह एक 10 सेमी पकवान में जगह है.
2. एक 500 मिलीलीटर की कुप्पी में 150 मिलीलीटर RPMI मीडिया रखो.
3. एक 250 मिलीलीटर फ्लास्क में, 100 मिलीग्राम / एमएल DNase और 5mg/ml Liberase आरआई के 20 मिलीलीटर के साथ 130 मिलीलीटर RPMI मीडिया संयोजन द्वारा पाचक एंजाइम समाधान तैयार करते हैं. इस समाधान का 10 मिलीलीटर सिरिंज में अग्नाशय के ऊतकों इंजेक्षन ड्रा.
4. अग्नाशय के ऊतकों में पाचक एंजाइम समाधान इंजेक्षन, यह homogeneously फैलाना लक्ष्य है. यदि यह तंतुमयता से रोका जाता है, पाचन की संभावना असफल हो जायेगी. अगले ~ 4 मिमी में ऊतक बर्फ पर ³ टुकड़े कीमा.

4. मानव अग्न्याशय पाचन सर्किट

1. पाचन सर्किट इकट्ठा के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है. Ricordi कक्ष में प्रवाह दिशा में नीचे और कक्ष के शीर्ष पर बाहर है.
2. शेष पाचक एंजाइम 500 मिलीलीटर फ्लास्क हल जोड़ें 300 मिलीलीटर की कुल मात्रा और एक थर्मामीटर डालें.
3. चैम्बर में अग्नाशय के ऊतकों स्थानांतरण, मेष (ताकना व्यास: 600 सुक्ष्ममापी) सम्मिलित करते हैं और तीन सिलिकॉन नाइट्राइड पत्थर (व्यास: 15 मिमी), चैम्बर बंद करने और 140 मि.ली. / मिनट पर सेट प्रवाह के साथ पंप शुरू.
4. जब सर्किट का तापमान 37 तक पहुँचता है डिग्री सेल्सियस, समय शुरू करने के लिए और समय - समय पर नमूने लेने के लिए निर्धारित करें जब पाचन को रोकने के लिए. Dithizone (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ धुंधला हो जाना ^पचा ​​4 ऊतक के भीतर islets की सूक्ष्म दृश्य की अनुमति देता है.
5. एक बार islets के आसपास कोष्ठकी ऊतक से अलग हो रहे हैं, हीटिंग का तार बर्फ पर रखने और ठंड धोने मीडिया के 200 मिलीलीटर (5.5 मिमी ग्लूकोज और 10% FBS के साथ 900 मिलीलीटर 1640 RPMI) सर्किट को जोड़ने के द्वारा जल्दी पाचन रोक.
6. लीजिए 250 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में आइलेट समाधान के रूप में यह नमूना ट्यूब के बाहर आता है. जारी रखें जब तक सर्किट खाली है.

चित्रा 1. और तीन सिलिकॉन नाइट्राइड पत्थर (व्यास: 15 मिमी): मानव अग्न्याशय पाचन सर्किट मानव अग्न्याशय पाचन सर्किट Ricordi जाल (600 सुक्ष्ममापी ताकना व्यास) युक्त कक्ष भी शामिल है. चैम्बर से बहना क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (140 मिलीग्राम / मिनट) द्वारा ऊतक संग्रह फ्लास्क के लिए प्रेरित है. तीर प्रवाह दिशा से संकेत मिलता है. Enzymatic पाचन के लिए एक इष्टतम तापमान हीटिंग का तार एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डुबो कर रखा है.

5. बाद पाचन धुलाई

1. 250 मिलीलीटर शंक्वाकार 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर आइलेट समाधान, 4 ° C से युक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, (5.5 मिमी ग्लूकोज और 10% FBS के साथ 900 मिलीलीटर 1640 RPMI) वॉश मीडिया में आइलेट गोली resuspend और यह 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के बराबर भागों में वितरित. (वैकल्पिक: अतिरिक्त शंक्वाकार धोने सुधार ट्यूबों में वितरित) 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र, 4 ° 5 मिनट के लिए सी.
3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे पुस्तिका मिलाते द्वारा छर्रों ढीला.

6. एक Ficoll ढाल पर शुद्धीकरण

1. Resuspend 1.125 जी / मिली, पीएच 7.4 की एक घनत्व Ficoll मीडिया के साथ गोली और धीरे धीरे 1.080, 1.060 और 1.037 जी / मिलीलीटर के घनत्व के साथ Ficoll मीडिया के 10 मिलीलीटर aliquots उपरिशायी.
2. 2400 rpm पर Ficoll gradients अपकेंद्रित्र, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस.

7. आइलेट संग्रह और संस्कृति

1. Centrifugation के बाद, विभिन्न ऊतकों घटक ढाल में अपने विभाजन से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
2. वसा और संयोजी ऊतक के निर्वाचकगण ऊपरी परत त्यागें.
3. ध्यान 1.037-1.060 interphase / छ मिलीलीटर में आइलेट समुच्चय की पहली परत फसल. इस परत सबसे शुद्ध पृथक islets हैं. कुशल अलगाव के लिए भिन्न अलग लीजिए.
4. दूसरा, आइलेट समुच्चय के 1.060-1.080 interphase / छ मिलीलीटर में कम शुद्ध अंश लीजिए.
5. धोने मीडिया को जोड़ने (5.5 मिमी ग्लूकोज और 10% FBS के साथ 900 मिलीलीटर 1640 RPMI) प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब के लिए 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा से Ficoll ढाल पतला. 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र, 4 ° 5 मिनट के लिए सी.
6. चूषण द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें. गोली ढीले Ficoll ढाल की वजह से हो सकता है के रूप में देखभाल का उपयोग करें.
7. छर्रों वाई धोवें धोने मीडिया (900ml 1640 RPMI 5.5 मिमी ग्लूकोज और 10% FBS के साथ) और 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र, 4 ° सी के 5 मिनट के लिए. आइलेट संस्कृति मीडिया का उपयोग दोहराएँ
8. संस्कृति मीडिया में islets Resuspend और उन्हें इनक्यूबेटर में 5% सीओ ₂ के साथ 37 पर जगह ° C आगे की प्रक्रिया से पहले 24-48 घंटों के लिए.

हमारी प्रोटोकॉल ~ 500 islets के अग्नाशय के ऊतकों के प्रति ग्राम के एक औसत झुकेंगे, हालांकि यह बहुत काफी हद तक तंतुमयता और collagenase गतिविधि में मतभेद की वजह से तैयारी के बीच विविध. हम Dithizone के साथ पहली धुंधला द्वारा ऊतक प्रसंस्करण के दौरान> 90% आइलेट शुद्धता हासिल की है, तो उन्हें अलगाव के बाद 24 घंटे handpicking. शुद्ध islets की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए, हम 2 घंटे के लिए स्थिर शर्तों के तहत 25 मिमी ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव के लिए परीक्षण किया गया. हम इंसुलिन स्राव ECIT आइलेट अलगाव और प्रत्यारोपण केंद्रों से प्राप्त islets के तुलनीय पाया. के रूप में आंशिक रूप से pancreatectomized pancreata से अलग islets आइलेट प्रत्यारोपण, कुल माना जाता था के लिए एक महत्वपूर्ण कारक नहीं किया जा IEQ के मूल्यांकन के लिए नहीं होती हैं.

महत्वपूर्ण बात, हमारे विधि हमें कार्यात्मक अध्ययन के लिए 2005 ^और 5 +२००८ के बीच 25 आंशिक pancreatectomized रोगियों से islets अलग करने के लिए सक्षम होना चाहिए. इन islets ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव और विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए पश्चिमी सोख्ता और immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण किया गया. आंशिक रूप से pancreatecomized pancreata से अलग islets भी करने के लिए जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल, ultrastructural उपस्थिति और गैर मधुमेह और मधुमेह islets के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. क्योंकि वहाँ अधिक आंशिक pancreatectomy वहाँ से अंग दाताओं के दौर से गुजर रोगियों रहे हैं, हमारे प्रोटोकॉल मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूनों और डेटा एकत्र करने के लिए अनुमति दे सकता है.

हमारे प्रोटोकॉल का प्रयोग, मानव islets अग्नाशय के एक आंशिक pancreatectomy से एकत्र ऊतक से अलग किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल की सफलता के कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं के दौरान लिया देखभाल पर निर्भर करता है. बीटा सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए, यह आवश्यक है कि नमूना प्रयोगशाला में बर्फ पर तेजी से ले जाया जा. इसके अतिरिक्त, ऊतक पाचन की अवधि के ऊतक तंतुमयता और मीडिया के enzymatic गतिविधि के ग्रेड के अनुसार empirically अनुकूलित चाहिए. यह यांत्रिक Ricordi चैम्बर के लिए मैन्युअल रूप से लागू बल की डिग्री के लिए भी सच है. एक अच्छा आइलेट उपज प्राप्त करने के इस प्रकार, प्रोटोकॉल सबसे अच्छा एक समर्पित वैज्ञानिक या तकनीकी सहायक द्वारा किया जाता है. प्रारंभिक विफलता आदर्श है जब तक कि टीम पहले से ही आइलेट अलगाव में अनुभवी है.

हमारे आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल और मानक मानव आइलेट अलगाव विधि के बीच प्रमुख मतभेद रहे हैं: 1) हालांकि हम अग्नाशय ischemia के कई घंटे के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान अधीन ऊतक का उपयोग, इसे तुरंत साइट पर संसाधित है. यह अग्न्याशय आइलेट / प्रत्यारोपण के लिए मस्तिष्क मृत दाताओं, जो आवंटन और आइलेट अलगाव की सुविधा के लिए प्रसव के दौरान कई घंटे के लिए इस्कीमिक रहना से explanted pancreata इसके विपरीत में है. 2) हम अग्नाशय के ऊतकों में सीधे collagenase इंजेक्षन, जबकि मानक प्रोटोकॉल के लिए यह अग्नाशयी नलिका में पानी में डालना है. 3) हम एक सतत Ficoll COBE सेल प्रोसेसर का उपयोग कर ढाल से islets एकत्रित करने के बजाय एक असंतत Ficoll ढाल का उपयोग islets अलग.

मामलों में जहां शल्य नमूना भी fibrotic या islets की एक पर्याप्त संख्या को अलग करने के लिए दुर्लभ है, ऊतक अभी भी लेजर कब्जा ^{microdissection} (LCM) 10 द्वारा लिया जा सकता है. इस जीन की अभिव्यक्ति डेटा लगभग हर नमूना से बरामद करने के लिए, भले ही आइलेट अलगाव विफल रहता है या उपज बहुत कम है की अनुमति देता है. दुर्भाग्य से, LCM कार्यात्मक अध्ययन के लिए जीवित कोशिकाओं का उत्पादन नहीं करता है और उनकी राशि आमतौर पर प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए अपर्याप्त है. इस प्रकार, हमारे collagenase पाचन प्रोटोकॉल के साथ समानांतर में LCM का उपयोग करने के लिए islets पुनर्प्राप्त शल्य नमूनों की प्रक्रिया का सबसे प्रभावी तरीका हो सकता है.

जब आंशिक pancreatectomies से आइलेट अलगाव के लिए ऊतक एकत्रित, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान से रोगी के नैदानिक ​​इतिहास और चयापचय राज्य की जांच. एक आंशिक रूप से pancreatectomized रोगी प्रकार -3 सी मधुमेह, ^{अग्नाशय} के 6 सर्जरी के लिए प्रमुख विकार के लिए माध्यमिक यानी मधुमेह से प्रभावित हो सकता है. 43 भाग लेने वाले रोगियों जो 2010 में हमारे विभाग में इस सर्जरी के अलावा, 32 गैर मधुमेह थे, 5 टाइप 2 मधुमेह और 6 से प्रभावित थे प्रकार -3 सी मधुमेह था. ये आंकड़े पिछले अध्ययनों और अग्नाशय के कैंसर या पुरानी ^{अग्नाशयशोथ} 6 से पीड़ित रोगियों का एक बड़ा अंश में बिगड़ा ग्लूकोज चयापचय और मधुमेह की ओर इशारा करते के साथ सहमत हूँ. हम मधुमेह पर विचार करने के लिए प्राथमिक मूल के हो सकता है अगर यह कम से कम एक साल ^का निदान अग्नाशय 7 सर्जरी करने के लिए अग्रणी लक्षण की शुरुआत से पहले था. आइलेट autoantigens के खिलाफ एंटीबॉडी के स्तर को ^भी 8 मधुमेह के एक संभावित autoimmune मूल का मूल्यांकन करने के लिए मापा जाना चाहिए. क्योंकि एक pancreatectomy दौर से गुजर रोगी मधुमेह undiagnosed से ग्रस्त या ग्लूकोज असहिष्णु हो सकता है, सभी गैर मधुमेह के रोगियों को एक मौखिक शर्करा सहिष्णुता ^पहले 9 pancreatectomy के लिए परीक्षण दिया जाना चाहिए .

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

हम हमारे कई सहयोगियों जो इस परियोजना के विभिन्न चरणों में मदद, सलाह और महत्वपूर्ण इनपुट प्रदान को धन्यवाद देना चाहता हूँ. इस वीडियो के लेख का उत्पादन शिक्षा और अनुसंधान (BMBF) के लिए जर्मन जर्मन मधुमेह (DZD, अनुसंधान के लिए केंद्र मंत्रालय से धन के साथ समर्थित किया गया था http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA (http://www imidia.org ) और विश्वविद्यालय अस्पताल प्रौद्योगिकी ड्रेसडेन के विश्वविद्यालय में कार्ल गुस्ताव Carus. इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान अनुदान समझौता ° पता 115005 के तहत अभिनव चिकित्सा पहल के लिए यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त किया है.

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