Introduktion till Ultraljud Riktade mikrobubblor Destruction Teknik

1. Mikrobubblor stamberedning

1. I 10 ml av PBS blanda 200 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylkolin och 50 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidyletanolamin med 1 g glukos.
2. Värm blandningen i kokande 20-30 vattenbad minuter, pipett blandning var 5 minuter.
3. Lösningen kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader.

2. Mikrobubblor Förberedelser

1. Ta en 250 l av det beredda mikrobubblor stamlösningen och inkubera vid 40 ° C i 15 minuter.
2. Den förvärmda mikrobubblor lösningen överförs sedan till en 1,5 ml mikrorör med 50 l av glycerol.
3. 1-2 mg renat plasmid-DNA kodar ett uttryck bygga för genen av intresse (renat i detta exempel genom att Qiagen Endotoxin fria MegaPrep kit, Qiagen, Germantown, MD, med en optimal koncentration av 4mg/ml). 2,4) fosfatbuffrad koksaltlösning läggs till en slutlig volym på 500 l. Endotoxin gratis Qiagen maxipreps används, liksom sterila PBS för att säkerställa sterilitet.
4. Luften i mikrorör ersätts därefter med Octafluoropropane gas.
5. Den mikrorör skall sedan skakas kraftigt i en tand amalgamator i 20 sekunder.
6. Den subnatant innehåller rester av DNA och buffert som inte har bundna till mikrobubblorna sedan försiktigt bort och mikrobubblor lagret tvättas tre gånger med sterilt PBS för att avlägsna lös DNA, och placeras på isen mellan varje tvättprogram. Vi uppnår vanligtvis en bindande verkningsgrad på 30-40%. Alla reagenser är sterila och omsorg görs för att minimera kontaminering.
7. Den plasmid DNA-bundna mikrobubblor placeras sedan på is i upp till två timmar till användning.
8. Den subnatant bort från mikrorör efter blandning och PBS tvättar, kan användas för att bestämma koncentrationen av obundet DNA, och likaså mängden bunden grundas på de kända ursprungliga koncentrationen, genom att mäta den optiska densiteten hos denna lösning vid en våglängd på 260nm med en spektrofotometer.

3. Utrustning Kalibrering

1. Före första användningen, behöver en 1 MHz kavitation givare måste kalibreras för att säkerställa korrekt mekaniskt index och puls upprepning. En submergible 1 MHz, 13mm, ofokuserad Givaren är ansluten till en 20 MHz Funktion / godtycklig vågform Generator via en förstärkare.
2. Givaren är placerad i en plastbehållare fylld med vatten, riktar sig direkt till en hydrofon, som har varit ansluten till en 500 MHz oscilloskop i form av en förstärkare.
3. Vågform, frekvens, amplitud, brast cykel och effektförstärkning alla ändras för att erhålla rätt duty cycle och mekaniskt index optimalt att kaviterade mikrobubblor. För det här experimentet har vi kalibrerat systemet till ett mekaniskt index som motsvarar ~ 1,3 vid 1 MHz.

4. Mikrobubblor Leverans & UTMD

1. Före mikrobubblor leverans och UTMD var C57BL / 6 möss bedövas med 100mg/kg ketamin och 5mg/kg xylazin via IP injektion.
2. Mikrobubblor leverans var administreras intravenöst genom en direkt injektion i vänster kammare i hjärtat eller genom svansvenen kateter. För direkt hjärt-injektion, en volym upp till 100 ìl av plasmid-DNA-loaded mikrobubblor lösningen injiceras genom en 30 gauge nål infogas i den främre 4: ^e interkostalrummet enligt ultraljud visualisering i vänster kammare i hjärtat.
3. Den mikrobubblor lösningen bolus härrör från vänster interventricular injektionen visualiseras med hjälp av Visual Sonics "38 MHz hög givarens frekvens ultraljud placeras i en stillastående position på bröstkorgen av musen i en lång-axeln visa med VisualSonics" VEVO 2100 Imaging System. Alla sprutor och nålar är sterila, försäkrar den mest steril miljö möjligt för dessa injektioner.
4. Omedelbart efter injektionen är mikrobubblor förstörelse genomförs för ~ 5 minuter med hjälp av en andra, mindre storlek låg frekvens 1,0 MHz transducer hålls direkt över önskat orgel, med inriktning förstörelse av denna region. I detta exempel var det ultraljud ges till levern vid en pulsrepetitionsfrekvens på 1,0 MHz, med en mekaniskt index motsvarande cirka 1,3-1,5 och pulsrepetitionsfrekvens period av 100 ms för varje 20 cykler. Alternativt kan pulsen vara gated till EKG på musen (visas inte i detta experiment) till en explosion av 3 bilder av ultraljud, var 4-6 hjärt cykler. Vi får ökad effektivitet av transfektion med protokoll som gör att kapillärbädd att fylla på med bubblor mellan utbrott av ultraljud.

5. Alternativa Leveransmetod

Vi valde att belysa interventricular injektion på grund av komplexiteten i förfarandet, men i många fall, till exempel långvarig infusion av mikrobubblor, en svans ven ijection är den bästa metoden. För tail-ven metod för mikrobubblor leverans är musen sövs på samma sätt. En spruta med plasmid-DNA-bundna mikrobubblor är ansluten till en 27 gauge / svansvenen kateter. Svansen ven kateter sätts in i distala tredjedelen av antingen höger eller vänster laterala vener som längs svansen på musen. Sprutan som innehåller mikrobubblorna är placerad i en insulinpump som automatiskt administrerar en enhetlig förinställd volym lösning under en förinställd tid. Vi ingjuta typiskt 200-300μl med en hastighet av 3ml/hour.

Användning av djur

Alla djur har hanterats i enlighet med god djur-praxis som fastställts av berörda nationella och / eller lokala djurkroppar välfärd, och allt djur-arbete godkändes av lämplig kommitté (University of Hawaii Institutional Animal Care och användning kommittén, godkännandenummer 07-100 -3). Lämpliga anestesi (ketamin / zylazine) användes och analgetika (Bupivicaine och buprenorfin) fanns tillgängliga, men inget krav.

6. Representativa resultat:

Effektiviteten i de UTMD-medierad plasmid-DNA leverans kan utvärderas genom olika metoder beroende på gener kodade i konstruktion, till exempel, men inte begränsat till, luciferas in vivo imaging-, B-gal ex vivo färgning, och / eller Immunohistology. I synnerhet in vivo bioluminescens bildbehandling gör att man kan kontrollera förekomsten och varaktigheten av genuttryck som serie i möss transfererats med en plasmid som kodar för ett självlysande reporter gen (luciferas). Den Xenogen In Vivo Imaging System (IVIS) (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) används för självlysande avbildning. Bilderna är oftast tas till alla möss den första dagen efter UTMD medierad transfektion och upprepas var tre till fyra dagar tills självlysande genuttryck är inte längre synliga i systemet (Figur 1). För att förbereda möss självlysande bildhantering, möss får först en IP-injektion av luciferas reportern sond D-luciferin (klave Life Sciences) och sedan bedövas ~ 3 minuter senare. Biodistribution av D-luciferin substrat tillåts fortsätta i ~ 10 minuter innan djuret placeras i IVIS avbildning kammaren och en fullständig kroppsuppfattning scan tas. Under förvärvet är fotoner avges från eldfluga luciferas / D-luciferin fotokemisk reaktion mätas. Figur 1 visar också liknande IVIS självlysande avbildning av levern efter UTMD och Figur 2 är en epifluorescence (100X) bild av transfekterade lever med en anti-luciferas primära antikroppen (Sigma-Aldrich) och AlexFluor-568 konjugerade sekundära antikroppar (Invitrogen) . Det är tydligt att se att UTMD förmedlade levern transfektion har påverkat inte bara endotelceller, men hepatocyes också.

Figur 1 Xenogen / IVIS ekokardiografi av UTMD behandlades möss (A) Negativ kontroll Mus:.. Plasmid + PBS följt av hjärt riktad UTMD, (B) Behandling Mus: Plasmid + bubblor följt av hjärt riktad UTMD, och (C) Behandling Mouse : Plasmid + bubblor följt av levern riktad UTMD.

Figur 2. Immunohistokemi av lever UTMD (anti-luciferas i rött). (A) Plasmid utan UTMD, och (B) Plasmid med UTMD. Konfokala bild (100X), kärnor DAPI färgas blå.

UTMD representerar ett nytt sätt att genen leverans. Som en plattform teknik kan kombineras med någon av de många potentiella strategier genterapi, för att leverera en myriad av bioaktiva molekyler då en hög grad av vävnadsspecificitet önskas. De viktigaste biologiska begränsningen av tekniken är den låga effektiviteten i transfektion. En annan viktig faktor är tillgängligheten till målorganet för ultraljud, vilket kan kraftigt minskas genom att ingripa ben eller luft. Tekniken kräver optimering av teknik baserad på målvävnaden ¹¹ samt en grundläggande förståelse av akustik, att begränsa vävnadsskada ¹¹ och öka effektiviteten. Däremot ger det en billig, snabb och repeterbar metod för att utvärdera effekten av vävnadsspecifika transgenen uttryck, och kan leverera effektiv behandling för sjukdomar där låga nivåer av transgens uttryck kan vara användbart.