형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

Klug, B., Rodler, C., Koller, M., Wimmer, G., Kessler, H. H., Grube, M., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (56), e2967, doi:10.3791/2967 (2011).

자연 이기종 biofilm의 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)은 얼룩 기법, 그들이 원위치 하이브리드화 (물고기)에서 형광되는 하나의 포괄적인 범위로 오늘날 용이합니다. ^{1,2, 우리는} 구강 biofilm 예제는 고정에서 수집하는 파일럿 연구를 수행 orthodontic 가전 (맛이 좋은 확장기)는 생선, 자연 biofilm 및 상패 축적의 3 차원의 조직을 평가하는 목적에 의해 스테인드되었습니다. ^3,4 물고기가 찬란 레이블 16를 사용하여 네이티브 biofilm 환경에서 세포를 얼룩 수있는 기회를 만듭니다 rRNA 타겟팅 프로브를. ^4-7,19이 immunofluorescent 라벨과 같은 다른 기술에 비해,이 혼합 biofilm의 컨소시엄에서 다른 박테리아 그룹을 조사 저렴, 정확하고 간단 라벨 기법입니다. ^18,20 일반 프로브가 사용하는 것을 Eubacteria에 바인딩 ( EUB338 + EUB338II + EUB338III; 이하 EUBmix), ^80-10 Firmicutes는 (LGC354 AC;. 이하 LGCmix), ^9,10과 Bacteroidetes (Bac303) ¹¹ 또한, 연쇄상 구균의 mutans에 바인딩을 특정 프로브 (MUT590) ^12,13과 Porphyromonas gingivalis의 (POGI) ^13,14 사용되었습니다 . 관련 표면 재료의 극단적인 경도 (스테인레스 스틸과 아크릴 수지)는 biofilm을 준비하는 새로운 방법을 찾는 우리에게 강요. 이러한 표면 물질이 쉽게 cryotome로 잘라 수 없습니다로서, 다양한 샘플링 방법은 그대로 구두 biofilm을 얻기 위해 탐험했다. 이러한 방식을 가장 가능한이 의사 소통에 표시됩니다. biofilm 운반 아크릴 수지의 작은 조각은 biofilm 구조를 손상하지 않도록 돌봐, 무균 메스로 긁어 냈했다. 집게는 철강 표면의 biofilm를 수집하는 데 사용되었습니다. 일단 수집, 샘플은 고정 및 polysine 코팅 유리 슬라이드에 직접 배치했다. 물고기가 프로브 m 이러한 슬라이드에서 직접 수행되었습니다위 entioned. 다양한 생선 프로토콜 결합하여 취급하기가 쉽고 새로운 프로토콜을 만들 수정되었습니다. ^{5,10,14,15은} 이후 샘플을 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 분석되었다. 잘 알려진 구성 ^3,4,16,17는 버섯 스타일의 형성 및 채널에 의해 줄다리기 coccoid 박테리아의 클러스터를 포함하여, 시각 수 있습니다. 또한, 이러한 전형적인 biofilm 구조의 세균성 조성 분석과 2D 및 3D 이미지는 만들어졌습니다.

1. 표본 수집

1. intraoral 서비스 4 개월 후 고정 맛이 좋은 확장기를 제거합니다. 그들 (그림 1 및 2) 제거하기 전에 어플 라이언 스를 분리 놀라 드라이 필드 시스템을 사용합니다.
2. 오염을 (그림 3, 4) 추가하지 않고 확장기를 제거하는 소독 펜치, 장갑과 쟁반을 사용합니다.
3. -20 ° C.에 Sarstedt 120 ML 튜브 안에 저장 개체 24 시간 이내에 얼음과 프로세스에 대한 실험실 소요됩니다.

2. Biofilm의 고정

1. 무균 메스 biofilm 부스러기를 긁어, 또는 멸균 집게와 조각을 수집합니다.
2. 샘플이 잘 적용되기 전까지 얼음처럼 차가운 4% PFA 솔루션을 추가합니다.
3. 4에서 혼합물을 품어 ° C 3-12시간위한 (동결하지 않음). 긴 고정 시간 이상 고정 온도는 oligonucleotide 프로브 적게 투과 그람 음성 세포의 세포 봉투를 렌더링 수 있습니다.
4. PFA 솔루션을 제거하고 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세척. R이 단계에게 2-3 번 반복잔류 PFA를 emove.
5. 1 권에서 샘플을 Resuspend. 얼음처럼 차가운 1X PBS과 추가 1 권. 얼음처럼 차가운 96% (V / V) 에탄올.
6. -20 ° C.에있는 샘플을 저장 이 프로토콜에 따라 고정 샘플 년 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

3. 고정 샘플의 탈수

1. 현미경 슬라이드에 PFA - 고정 샘플 자료 5-30 μl을 적용합니다.
2. 46시 드라이 ° C 15 분 이상 실온에서. 라이 소 자임과 포름 아미드를 해동.
3. 따라서 세포 벽의 부분 파괴하여 세포에 프로브의 침투를 촉진 10 분 상온에서 라이 소 자임 (1mg/ml) 250 μl를 추가합니다.
4. 50 %, 80 % 96% (V / V) 3 분 각각 에탄올로 물놀이 슬라이드. 에탄올 농도 시리즈의 dehydrating 효과는 세포 세포막을 분해합니다.
5. ° C 10 분에 대해 46에서 슬라이드를 건조시킵니다.

4. 원위치 하이브리드화

1. 1 ML 준비신선한 하이브 리다이 제이션 버퍼 (농도에 대한 표 1 참조). 이 연구에 사용된 포름 아미드 농도 : 10 % (EUBmix), 20 % (Bac303, POGI, MUT590) 또는 45 % (LGCmix).
2. oligonucleotide 프로브 솔루션을 녹여. 해동 프로브는 얼음에 보관하고 빛으로부터 보호되어야합니다.
3. 하이브 리다이 제이션 버퍼 200 μl 각 프로브 2 μl를 추가, 잘 섞어 현미경 슬라이드에 건조 표본으로 혼합물을 적용합니다.
4. 사각형 페트리 접시에 조직 종이를 삽입하고 티슈에 남아있는 하이브 리다이 제이션 버퍼를 부어.
5. 바로 그릇에 가로 슬라이드를 장소와 요리를 닫습니다. 46 ° C에서 1-5시간 (90 분 대부분의 경우 충분합니다) 오븐에 품어. 수분 챔버로 요리 기능은 슬라이드에서 하이브 리다이 제이션 솔루션의 증발을 방지. 특히, 포름 아미드의 증발이 아닌 목표 세포가 아닌 특정 탐사선이 바인딩을 일으킬 수 있습니다.
6. (conce에 대한 표 2를 참조하십시오 세척 버퍼의 50 ML 준비ntrations). 48 50 ML 튜브와 앞서 열을 가하다에서 세탁 버퍼를 준비 ° C 물 목욕 인치 세척 단계는 48 ° C.에 수행됩니다
7. 하이브 리다이 제이션 오븐에서 슬라이드로 접시를 제거합니다. 즉시 미리 예열 세척 버퍼의 작은 볼륨으로 하이브리드화 버퍼 씻어, 나머지 세척 버퍼에 슬라이드를 전송합니다.
8. 10-15 분 48 ° C에서 물이 욕조 및 부화로 다시 세척 버퍼와 슬라이드가 들어있는 튜브를 놓습니다.
9. 튜브에서 슬라이드를 제거하고 잔류 세척 버퍼를 제거하는 2~3초 위해 얼음처럼 차가운 ddH ₂ O로 물놀이.
10. 가능한 한 빨리 슬라이드 (압축 공기의 사용이 권장됩니다) 공기 건조. 빠른 건조가 프로브 분리를 줄일 수 있습니다.
11. 말린 슬라이드는 프로브 - 수여 형광 신호의 상당한 손실없이 몇 주 동안 -20 ° C에서 어둠에 저장할 수 있습니다.

5. 현미경 사용법

1. 후 생선 세척, appl슬라이드의 왼쪽과 오른쪽 엔드 (냉동 슬라이스가 이전 단계로 실내 온도로 예열한다)에 antifadent 가까이 Y 두 방울.
2. 현미경 커버가 상단에 실수 antifadent가 전체 슬라이드에 걸쳐 때까지 기다려 놓습니다. antifadent의 과도한 양의 현미경 이미지를 흐려 수 있습니다.
3. 적절한 필터 또는 레이저를 갖춘 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 샘플을 관찰합니다. 우리는 Leica TCS 단위 (; NA 1.2 HCX PL APO/63x)를 사용합니다. 데이터는 같은 IMARIS 또는 AMIRA와 같은 소프트웨어와 함께 분석할 수 있습니다.
4. 프로브 - 수여 형광이 감소하기 시작하기 전에 antifadent에 포함된 슬라이드는 ° C (동결하지 않음) 최대 7 일 동안 4에 저장할 수 있습니다. 또는 antifadent는 ddH ₂ O와 제거 수 있으며, 말린 슬라이드는 오랜 기간 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

6. 대표 결과 :

(고정 orthodontic 기기에서 biofilm을 근근이 살아가고그림 5) 현미경에 대한 코팅 유리 슬라이드에 직접 hybridized 수 있습니다 적합 조각 (그림 6)를 산출. 이러한 방법으로 orobiome 박테리아의 다른 그룹이 다르게 표시된 특정 프로브 (그림 7 및 8)로 태그 세균성 rRNA하여 자연 입체 환경에서 확인할 수 있습니다. 그림 7에서 biofilm은 EUBmix (녹색, 모든 세균)과 LGCmix (노랑, Firmicutes)와 스테인드했습니다. 그들은 노랑, 파랑 물들일 것처럼 Firmicutes은 녹색으로 표시됩니다. 그림 8에서 biofilm은 EUBmix (빨강, 모든 박테리아), Bac303 (파란색, Bacteroidetes)과 POGI (노란색, Porphyromonas의 gingivalis)와 스테인드되었습니다. 세 프로브는 DNA와 중복에 바인딩으로 Porphyromonas의 gingivalis이, 노란 흰색에 표시됩니다 하얀 신호에 색상 결과. 박테리아의 그룹 간의 형태학의 차이는 또한 (그림 9 및 10) 확인할 수 있습니다. coccoid 박테리아의 큰 클러스터는 (녹색, 모든 바 얼룩이 EUBmix로 수행된 그림 9에 표시됩니다cteria). 구강 박테리아의 다른 모양은 coccoid 및 filamentous 박테리아가 EUBmix (적색)와 얼룩으로 구분할 수있다 그림 10에 시각되었습니다. 또한 biofilm의 전형적인 버섯 모양의 구조가 CLSM 데이터의 3D 모델링 (그림 11 및 12)를 통해 처리할 수하면 3D 모델링의 동영상을 감상하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1. 원위치로 맛이 좋은 확장을 수정.

그림 2. 노라 드라이 필드 시스템.

그림 3. 펜치, 장갑 및 트레이를 소독.

그림 4. 확장기를 제거했습니다.

그림 5. 무균 메스와 biofilm을 근근이 살아가고.

그림 6. 수지 조각은 직접 코팅 유리 슬라이드에 hybridized.

그림 7 CLSM 이미지 :. 특정 박테리아 그룹의 차별. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. Biofilm은 EUBmix (녹색, 모든 세균)과 LGCmix (노랑, Firmicutes)와 얼룩.

그림 8 CLSM 이미지 :. 특정 박테리아 그룹의 차별. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. EUBmix (빨강, 모든 박테리아), Bac303 (파란색, Bacteroi과 Biofilm 자국detes)와 POGI (노란색, Porphyromonas gingivalis의).

그림 9 CLSM 이미지 :. 특정 morphologies의 차별화. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. Biofilm은 EUBmix (녹색, 모든 박테리아)과 얼룩. coccoid 박테리아의 대형 클러스터 (화살표).

. 그림 10 CLSM 이미지 : 특정 morphologies의 차별화. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. Biofilm은 EUBmix (빨강, 모든 박테리아)과 얼룩. Coccoid (아래 화살표)와 filamentous 세균 (위 화살표)를 구별하실 수 있습니다.

그림 11. 버섯 구조 아래에서 3 차원 전망이 있습니다. EUBmix 및 proce 물들일 biofilm 조각 (orthodontic 어플 라이언 스의 표면 긁어 냈어요)의 스택IMARIS (CLSM 이미지)와 함께 ssed.

그림 12. 버섯 구조, 3D 측면 볼 수 있습니다. IMARIS (CLSM 이미지)와 함께 처리 biofilm 조각 (orthodontic 어플 라이언 스의 표면 긁어 냈어요)의 스택.

하이브 리다이 제이션 버퍼의 표 1. 성분 (μl의 농도).

세척 버퍼의 표 2. 성분 (μl의 농도).

영화는 1. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.

설명한 프로토콜 계약은 하드 자료의 수집 얼룩 biofilms에 매우 가능한 접근이다. 샘플링과 하이브 리다이 제이션은 가장 중요한 단계입니다. 샘플링 기간 동안주의가 충분한 두께의 조각이 biofilm 구조가 그대로 유지하기 위해 수집되는 이동해야합니다. 하이브 리다이 제이션 동안, 그것은 따라서 찬란 분류 프로브가 아닌 특정 바인딩 또는 바인딩의 손실을 피하고, 온도 과도한 변동을 피하기 위해 필수적입니다. 이 물고기 프로토콜의 구성을 방해하지 않고 직접 유리 슬라이드에 정상적인 이기종 biofilm을 얼룩이 우아한 방법입니다. 슬라이드 바로 다시 샘플을 이동하지 않고 현미경을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 방식으로, 튜브에 얼룩 이상의 개선이 biofilm에 적용되는 더 적은 전단 강제로 이루어집니다. > 50 μm의 두께의 조각이 방식으로 준비하고 조사 수 있습니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 작품은 의과 대학 그라츠의 위생 Fonds에 의해 지원되었다. 모든 과목들은 정보에 동의했다. 연구 프로토콜의 기관 승인 의과 대학 그라츠로부터 얻은 것입니다.

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