Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

1. Intraserebroventriküler enjeksiyon

1. İlk adım enjeksiyon stok çözümler hazırlanması; bu çözümler viral vektör, plazmid DNA, uyuşturucu ve steril koşullar altında enjekte edilmelidir.
2. Istenen bir viral vektör (5-7 mcL toplam) titresi 0.05% w / v tripan mavi enjeksiyon görünüm için PBS ile karıştırın.
3. Plazmid DNA solüsyonu (5 l mcL toplam) D-(+)-glikoz oranı% 20 (w / v) (1 mcL), tripan mavisi (% 0.05), PBS (1 mcL), plazmid (~ 5 ~ g / ~ L içerir. ) (2 ~ L) ve 2.5 kDa doğrusal PEI homopolimer (150 mM) (1 ~ L).
4. PND 2 yenidoğanlarda cryo anestezi ile 1-2 dakika boyunca hareketsiz.
5. Bu enjeksiyon için kullanılan iğne, uzun bir tüp aracılığıyla 3ml 3 mL Hamilton şırınga takılı bir mikro-litre kalibre steril cam mikropipet.
6. Kafatasının içine 2 mm penetrasyon için ayarlamak için (spatula ile) iğne ucu kırın. Enjeksiyon çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüp çapraz iğne yerleştirin. Şırınganın pistonu dikkatlice çekerek iğne içine enjeksiyon çözüm yükleyin.
7. Çözüm alındıktan sonra, tüpten şırınga ilişkisini; piston daha yukarı çekin ve sonra tekrar iğne eklemek.
8. Sağ el başparmak ve işaret parmakları arasında Hold iğne ve şırınga pistonu dokunmadan sağ elin avuç içi ile orta ve yüzük parmakları arasında yerleştirin.
9. Immobilize fare ilgili anatomik yapıların bir kılavuz olarak kullanılabilir aydınlatmak için sol eliyle yer ve bir fiber-optik ışık kullanarak deri başın arkasında sıkıca kavrayın.
10. Bir konuma yaklaşık 0,25 mm lateral sagital sütür ve yenidoğan koroner dikiş (Şekil 1A) 0,50-0,75 mm rostral, kafatası yüzeye dik, derin iğne 2 mm yerleştirin. Sonra avuç kullanarak piston itme sağ eli çok yavaş ve dikkatli bir şekilde. Rüptüre damarlar ya da yüzde şişme izleyin.
11. Geri akışı önlemek için piston hareketi kesildikten sonra iğne 15 saniye kaldırın.
12. Kurtarma hareketi ve genel tepki restore kadar ısıtılmış bir kapta 5-10 dakika süreyle fareler tutmak için.

2. Intravenöz enjeksiyon yoluyla temporal / facialis'ten

1. Enjekte edilebilir bir çözüm hazırlanmış ve süzülmüş yeşil gıda boyası ile desteklenmiş 1:100 dilüsyon ve steril koşullar altında enjekte edilmelidir.
2. 100 mcL cam Hamilton şırınga sonuna kadar döner küçük bir plastik takın. Döner, 33 gauge 0,25 inç derialtı iğne takın. Bütün parçaları sıkıca bağlı olduğundan emin sigortalayın.
3. Sağlanması, hava, damar içine hava enjeksiyon şeklinde şırınga olduğunu şırınga enjekte edilecek hacim yükleyin ölümcül. Genellikle pipetlemeyin parafilm bir parça şöyle enjekte edilecek hacim yardımcı olur. Bu açık bir görünüm için şırıngaya çözüm alımını sağlar.
4. Wee Sight transilluminator'de kolayca yenidoğanda temporal ven veya yüz damar, (Şekil 2A) görselleştirmek için kullanılır. Enjeksiyondan önce, cerrahi bant kullanarak transilluminator'de yenidoğan güvenli. Tül hayvan derisine zarar bandı önlemek için yenidoğan ve teyp arasında yer almalıdır. Bant solunum engellemez sağlanması, hayvan yan transilluminator'de sabitleyin. Yenidoğan boyun hafifçe facialis'ten kolayca görünür olduğunu açık olmalı ve burun baş stabilize etmek için bantlanmış olmalıdır.
5. Kolay görünüm için izin 2.25X bir kafa bandı büyüteç kullanarak, yavaş yavaş damar içine iğne takın. Iğne deri altında görünür kalmalıdır, böylece damar çok yüzeysel.
6. Çözelti hacmi, damar içine yavaşça demleyiniz. Yeşil boya enjeksiyon kolay görüntülenmesini sağlar.
7. Iğne, şırınga ve son derece dar bir iğne deliği nedeniyle kalan çözüm sürülmesi tamamen Medyumu arasında bir gecikme var gibi çıkarmadan önce 15 saniye bekleyin.
8. Iğneyi çıkardıktan sonra, enjeksiyon yerinde kanama geçene kadar baskı uygulamak için gazlı bez kullanın.
9. Sıkıntı belirtileri yenidoğan izleyin. Uygun bir enjeksiyondan sonra, hiçbir belirgin sıkıntı dikkat edilmelidir. Yenidoğan kafesine döndü önce kurtarmak için yaklaşık 5 dakika verilmelidir.
10. Iğne kan hızlı bir şekilde küçük bir delik nedeniyle bu yapışmasına neden olarak, PBS ile enjeksiyonlar arasında iğne / şırınga birimi yıkayın.

3. Temsilcisi sonuçları:

ICV enjeksiyon: beynin farklı zaman noktalarında enjeksiyon sonrası hasat edilen ve başarılı bir enjeksiyon tekniği göstermek için görüntülenebilmekte. Boya enjeksiyon çözüm değilse, o, doğruluğunu kontrol etmek için zor olacakEnjeksiyon. Ventriküller biri doğru enjeksiyon beyin enjekte edilen tarafta tripan mavi dağılımını sağlayacaktır yaklaşık 10-15 dakika sonrası enjeksiyon (Şekil 1B). Sağ ve sol serebral hemisferlerin ve koku ampuller tripan mavi tekdüze dağılım yaklaşık 60 dakika enjeksiyon (Şekil 1C) görülebilir. Bu mavi boya komşu ventrikül yayılmasına izin verecek serebral ventriküllerin bağlantısı nedeniyle. Doğru enjeksiyonları da yaklaşık 12 saat sonrası enjeksiyon (Şekil 1D) içinde rostral santral spinal kanal mavi boya dağılma tarafından görüntülenmiştir olabilir. Yanlış enjeksiyonları hemisferlerin eksikliği mavi renk ile ayırt edilebilir. Bu durumda, iğne derinliği yeterli değildi ve enjeksiyon çözüm muhtemelen deri altında dağıttı. Alternatif bir olasılık iğne böylece ventrikül ve çözüm serebral ventriküllerin altında boşaltılır ötesine geçen, beynin çok derin nüfuz ettiğini.

IV enjeksiyon: Doğru ve verimli temporal / facialis'ten enjeksiyon enjeksiyonu takiben hemen görüntülendi olabilir. Çözüm enjekte edilir, yeşil boya görselleştirme giren ve yüz ven (Şekil 2A) akan bir çözüm sağlar. Ayrıca, fare değişmiş ten rengi aşağıdaki enjeksiyon görülecektir. Yenidoğan normal pembe renk enjeksiyon çözüm yeşil gıda boyası (Şekil 2B) varlığı nedeniyle, yeşil dönüştürülür. Yenidoğan döneminde gözlenen yeşil renk değişimi ölçüde kullanılan boya konsantrasyonu bağlıdır. Enjeksiyon ve basit bir uygulama döneminde görselleştirme, 1:50 seyreltme tavsiye edilir. Bununla birlikte, dramatik bir şekilde değişmiş cilt tonu genellikle yavru annesi tarafından reddedilen ve bu nedenle deneysel işlemleri sırasında, boya veya önemli ölçüde azaltılmış bir konsantrasyon kaldırılması düşünülmelidir. Bir yanlış enjeksiyon, enjeksiyon yerinde deri altında yeşil boya birikimine neden olur. Iğne açılış tam damar içinde takılı değilken oluşur Eksik enjeksiyon, bazı çözüm damar akar ve bazı cilt altında birikir. Bu görülürse damar içine iğne daha takılı olmalıdır.

Şekil 1 PDN2 farelerde başarılı ICV enjeksiyonları gösterilmesi A) ventriküller içine ICV enjeksiyonları kullanılan enjeksiyon siteleri şematik B) PBS tripan mavisi ile sol ventrikül Pup enjekte ICV Beyin, fotoğraf 15 dakika enjeksiyon alınan C ICV gelen) Beyin PBS içinde tripan mavisi ile sol ventrikül Pup enjekte, alınan fotoğraf 60 dakika enjeksiyon. D) Rostral merkezi spinal kanal ICV gösterilir sol ventrikül PBS tripan mavisi ile yavru enjekte, 12 saat sonrası enjeksiyon alınan fotoğraf.

Şekil 2 PDN2 farelerde başarılı IV enjeksiyonlar gösterilmesi A) IV enjeksiyon için kullanılan facialis'ten şematik B) PBS içinde yeşil boya ile Pup enjekte IV un enjekte littermate göre, Foto hemen sonrası enjeksiyon alınır.

Araştırma hastalık fare modelleri kullanarak sık sık yenidoğanlarda ilaçlar ya da diğer maddelerin uygulanmasını gerektirir. Bu video gösteren adım adım MSS hedef için kullanılabilir iki tür enjeksiyon stratejileri içeren prosedürler: direkt enjeksiyon, intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonu kullanan MSS 1) veya temporal / hedef 2) IV enjeksiyon facialis'ten. Bu enjeksiyonların zamanlaması büyük önem taşıyor. ICV enjeksiyonları freehand olduğundan, kafatası nispeten uysal olmalıdır. Bu tip enjeksiyon yaşamın ilk bir hafta boyunca sadece ve giderek daha zorlu ve hayvanların yaşı gibi hayvanlar için zararlı olur. Ancak, birincil yararı etkili bir şekilde kan beyin bariyerini atlayarak, doğrudan dağıtım MSS elde olmasıdır. Bu nedenle, bir araştırmacı MSS terapötikler gelişmekte ise, tam kan beyin bariyeri geçirgenliğinin olarak uyuşturucu gibi özellikleri için optimize edilmiş değildir bileşikleri analiz etmek mümkündür, ancak, bileşik aktivitesi, hastalık ile ilgili dokularda ölçülen olabilir. Bu genel intravenöz için nispeten non-invaziv bir teknik olarak, yaşamın ilk birkaç gün boyunca temporal ven kullanın değerli olduğunu kanıtlamıştır. Bu gelişimsel aşamada, hiçbir ek damarlar, kolay erişilebilir, ömrü ⁵ ikinci haftasında daha erişilebilir hale kuyruk ven olarak. Her iki enjeksiyon teknikleri güvenli ve herhangi bir zararlı yan etkisi olmadan, kısa bir süre enjeksiyon sonra kurtarma fareler, freehand yapılabilir. Her iki teknikte de hayvanların bir grup, kısa bir süre içinde hızlı bir şekilde enjeksiyon için uygundur. Onlar, başarılı bir enjeksiyon sağlamak için hedeflenen bölgenin uygun görselleştirme gerektirir. Bu transilluminator'de ve büyüteç kafa bandı IV enjeksiyon (Tablo 1) ve ICV enjeksiyon bir fiber-optik ışık tarafından sağlanmaktadır.

IV enjeksiyon avantajlarından biri, büyük hacimli (100 ∞ Ll) ~% 90 başarı ^oranı 6 ile enjekte edilebilir olmasıdır . IV tekniği öğrenirken karşılaşılan ortak sorunlar subkutan enjeksiyonlar ve / veya eksik enjeksiyonları ile sonuçlanan iğne yanlış yerleştirilmesini içerir. Bu sorunlar konik iğne iyice gemi geçirilir sağlayarak karşılık olabilir. İğne yeteri kadar konik iğne tamamen gemi ile çevrili olduğunu, damar içine takılı olmalıdır. Ayrıca, geminin son derece yüzeysel, böylece enjektör iğnesi altındaki gemi ve emin olmanız gerekir. Iğnenin damarda olup olmadığını kontrol için, yerleştirildikten sonra iğne hafifçe yan yana taşındı olmalıdır. Iğne damar nüfuz varsa, damar iğne ile birlikte hareket edecek. Geminin hareket etmiyorsa, iğne doğru şekilde takılmamış. Enjeksiyondan önce bu onay Sahne başarılı enjeksiyonları sayısı artacaktır. AAV9 vektörlerin Yenidoğan teslim son ^zamanlarda 7,8 SMA fareleri rekombinant AAV vektörleri kullanılarak motor nöronların yüksek bir oranda başarıyla uyum sağlamak kullanılmıştır .

ICV enjeksiyon sırasında en önemli husus, iğne ucu uzunluğu içerir. Yeterince uzun, kafatasının içinde en az 2 mm nüfuz ucu olmalıdır. Ucu yeterince uzun değilse, iğne verimli ventriküller içine girmek mümkün olmayacaktır. Alternatif olarak, ucu çok uzunsa, bu enjekte edilecek çözümün alımını engelleyen ve aynı zamanda kırılgan bir ucu kafatası yoluyla doğru rehberlik etmek zordur oluşturur. Iğne açısı, sagital sütür doğru ucu ile kafatası dik tutarak ventrikül içine tam olarak nüfuz sağlamak için önemlidir. ICV enjeksiyonları hastalıklı fareler modelleri ^4,9-17 CNS, bileşikler, ilaç, tedavi RNA'lar, plazmid DNA'lar ve viral vektörlerin tanıtmak için çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır . Ancak, ICV enjeksiyon sınırlayıcı faktör, küçük kapasiteli yenidoğan farelerin serebral ventrikül terapötik ajanlar istenen hacmi penetrasyon izin vermeyebilir. Bu nedenle, zaman kısa bir süre içinde, daha düşük bir vektör doz kullanılarak tedavi ifade seviyelere ulaşmak için yetenek teslim hacmi sınırlı olduğu özellikle önemlidir.