マウスの脳室内（ICV）と静脈（IV）注入による治療薬のデリバリー

1。脳室内注入

1. 最初のステップは、注入ストック溶液の調製であり、これらのソリューションは、ウイルスベクター、プラスミドDNA、薬物、そして無菌条件下で注入されるべきです。
2. 注射部位の可視化のためにPBSでw / vのトリパンブルー0.05％ウイルスベクター（5-7μL合計）の所望の力価を混ぜる。
3. プラスミドDNA溶液（5リットルμL合計）は、D -（+） - グルコース20％（w / v）の（1μL）、トリパンブルー（0.05％）PBS（1μL）、プラスミドを（〜5〜G /〜Lが含まれています）（2〜L）、および2.5 kDaの線形PEIホモポリマー（150 mM）の（1〜L）。
4. 1〜2分のための低温麻酔を介してPND 2新生児を固定化する。
5. この注射用針は、長い管を通って3ミリリットル3mLのハミルトンシリンジに接続されているマイクロリットルのキャリブレーション滅菌ガラスのマイクロピペットです。
6. 頭蓋骨に2mmの浸透のために調整するために針の先端を（スパチュラ付）ブレイク。注入溶液の入ったマイクロ遠心チューブに斜めに針を置きます。慎重に注射器のプランジャーを引いて、針に注射のソリューションを読み込みます。
7. ソリューションの取り込み後に、チューブからシリンジを切り離し、さらにプランジャーを引き上げてから、再度針を取り付けます。
8. 親指と人​​差し指の間に右手の針を持ち、右手の手のひらに触れるプランジャーと中指、薬指の間に注射器を置きます。
9. ガイドとして使用することができる、関連する解剖学的構造を照らすために光ファイバの光で左手と場所を使って頭の後ろの皮膚がしっかりと固定されたマウスをつかみます。
10. 場所矢状縫合の外側約0.25 mmおよび新生児の冠状縫合（ 図1A）の吻側0.50〜0.75ミリメートルで、頭蓋骨の表面に垂直に、深く針2mmの挿入し、の手のひらを使用してプランジャーを押し右手非常にゆっくりと慎重に。破裂血管や顔の腫れのために監視する。
11. 逆流を防ぐために、プランジャーの動きの中止後に針15秒を削除します。
12. 運動と一般的な応答性が復元されるまで回復するには、温めておいた容器に5〜10分間マウスを保つ。

2。時間/顔面静脈を経由して静脈注射

1. 注入される溶液を調製し、濾過緑色食品色素で補足1:100希釈で、無菌条件下で注入する必要があります。
2. 100μLガラスハミルトンシリンジの最後にルアー小さなプラスチックを取り付けます。ルアーに、33ゲージ0.25インチ皮下注射針を取り付けます。すべての部品がしっかりと接続されていることを保証する。
3. 容器への空気の注入は致命的であるようにシリンジ内に空気がないことを確認し、注入する量で注射器をロードする。それは多くの場合、ピペットパラフィルムの一部わたし注入されるボリュームに便利です。これにより、シリンジへの液の取り込みを明確に可視化することができます。
4. ウィー視力のトランスは、簡単に新生児における浅側頭静脈、または顔面静脈、（図2A）を可視化するために使用されます。注射の前に、サージカルテープを使用してトランスに新生児を確保する。ガーゼは、動物の皮膚を損傷からテープを防ぐために、新生児とテープの間に配置する必要があります。テープは、呼吸を妨げないようにすること、その側のトランスに動物を固定します。新生児の首をやさしく顔面静脈が簡単に表示されるようにする必要があり、鼻は頭部を安定させるためにテープで固定してください。
5. 簡単に可視化を可能にするために2.25Xヘッドバンドの拡大鏡を使用して、徐々に静脈に針を挿入する。針が皮膚の下に表示したままにするので、静脈は非常に表面的です。
6. ゆっくり静脈内に溶液の体積を吹き込む。緑色の染料は、注入の容易な視覚化することができます。
7. 完全にシリンジと極めて狭い針の穴のために残りの溶液の追放のプランジャーを押す間にタイムラグがあるので針を外す前に15秒を待ちます。
8. 針を除去した後、出血が停止するまで注射部位に圧力を適用するためにガーゼを使用してください。
9. 苦痛の徴候のための新生児を監視します。適切な注入後は、明白な苦痛は認めてはならない。新生児は、それがケージに戻される前に回復するために約5分間を与えられるべきである。
10. 針で血液がすぐに小口径のためにそれを目詰まりするので注射の間にPBSで針/注射器ユニットをフラッシュします。

3。代表的な結果：

ICV注入：脳は様々な時点注射後に収穫し、成功した注入技術を実証するために視覚化することができます。染料を注射液に添加されていない場合、それはでの精度をチェックすることは困難ですjection。心室のいずれかの適切な注入は、脳の注入側にトリパンブルーの配布が可能になります約10-15分のポスト噴射（ 図1B）。右と左大脳半球および嗅球の両方でトリパンブルーの均一な分布は、約60分の注射後（ 図1C）表示されます。これは、隣接する心室に青色色素の普及を許可する脳室の接続によるものです。正確な注射はまた、約12時間注入後（ 図1D）内の吻側、中央脊柱管に青い色素の分散可視化することができる。不正確な注射は、大脳半球の青色の欠如によって区別す​​ることができます。このケースでは、針の深さは十分ではなかったとされた注射液は、おそらく皮膚の下で配布されている。別の可能性は針、それによって心室と解決策が脳室の下に空に越えて渡して、脳にあまりにも深く浸透していることです。

IV注入：正確で効率的な時間的/顔面静脈注射は、注射の直後に視覚化することができます。解決策が注入されるように、緑色の色素が入ると顔面静脈（ 図2A）を流れる液の可視化が可能になります。さらに、マウスの改変された肌の色は、注射後に観察されます。新生児の正常なピンクの色は、注射液（ 図2B）における緑色食品色素の存在のために緑、に変換されます。新生児において観察された緑色の色の変化の程度は、使用する色素の濃度に依存している。注射のと練習期間中の単純な可視化のため、50倍希釈を推奨します。しかし、劇的に変化した肌のトーンは多くの場合、母親によって拒否される、したがって、染料または大幅に減少濃度の除去は、実験手順中に考慮すべき子犬をもたらす。不正確な注射は、注射の部位の皮膚の下に緑色の色素の蓄積になります。針の開口部が完全に静脈内に挿入されていない場合に発生する不完全な注射は、、いくつかのソリューションは、静脈を流れるときに見られると、一部は皮膚の下に蓄積されています。これが認められる場合は、針が血管にさらに挿入される必要があります。

図 PDN2マウスで成功したICV注射1。デモンストレーション。）心室にICV注射で利用される注射部位の模式図。ICVからの脳が左心室にPBSでトリパンブルーの仔注入B）、写真は15分にポスト噴射を撮影。C ICVから）脳は、左心室にPBSでトリパンブルーで子犬を注入、撮影した写真は、60分の注射後。D）吻側、中央脊柱管がICVに示されているが、左心室にPBSでトリパンブルーで子犬を注入、12時間注入後に撮影した写真。

子犬が非注入同腹と比較してPBSで緑の色素でIVを注入図 IV注射のために利用さ顔面静脈の2。PDN2マウスで成功したIV注射のデモンストレーション。）回路図は。B）、写真はすぐにポスト噴射を取ら。

病気のマウスモデルを用いた研究は多くの場合、新生児に薬物または他の物質の投与を必要とします。このビデオでは、我々はステップバイCNSを標的とするために使用できる注射戦略の2つのタイプに関連するステップの手順を示す：脳室内（ICV）注射を利用したCNSに）直接注入を1;時間/をターゲット）、または2のIV注入顔面静脈。これらの注射のタイミングは非常に重要です。 ICV注射はフリーハンドなので、頭蓋骨は比較的可鍛性にする必要があります。注射のこのタイプは、人生の最初の週を介してのみ可能であり、そしてますます多くの挑戦や動物の年齢などの動物に有害となる。しかし、主な利点は、効果的に血液脳関門をバイパスし、中枢神経系への直接配信が達成されていることです。したがって、研究者は、CNS治療薬を開発している場合、それは完全にそのような血液脳関門透過性などの薬剤のような性質のために最適化されていない化合物を分析することが可能である、しかし、化合物の活性は、疾患関連の組織で測定することができます。これは一般的な静脈内投与のための比較的非侵襲的方法であるように人生の最初の数日間の間に時間的な静脈の使用は、貴重な証明されています。この発達段階では、追加の静脈は、そのような生命⁵の第2週の間に、よりアクセス可能になる尾静脈など、簡単にアクセスすることはできません。両方のインジェクション技術は、安全であり、いかなる有害な副作用なしで注射後間もなく回復するマウスと、フリーハンドを行うことができます。両方の技術は、短期間での動物のグループの急速な注入に適しています。彼らは、対象地域の適切な可視化が成功注入を確実にする必要があります。これは、IV注入（ 表1）およびICV注入における光ファイバの光でトランスと拡大鏡ヘッドバンドによって提供されます。

IV注射の利点の一つは、大きなボリューム（100∞LLは）〜90％の成功率⁶で注入することができますされていること。 IVのテクニックを学習しながら発生する共通の問題は、皮下注射および/または不完全な注射で、その結果針置き間違いが含まれています。これらの問題は徹底的に容器を介してスレッド化されている針のベベルを確保することによって対抗することができます。針は十分針のベベルが完全に容器に囲まれている血管に挿入する必要があります。また、容器は非常に表面的である、したがって、インジェクタは、針が血管内ではなく、その下にあることを確認する必要があります。針が血管内にあるかどうかを確認するには、配置後に針を静かに左右に移動する必要があります。針が血管に侵入した場合、容器は、針と一緒に移動します。船が移動しない場合は、針が正しく挿入されていません。注射の前にこのチェックを実行して成功した注射の数が増加します。 AAV9ベクトルの新生児の配信は、最近成功したSMAマウス^7,8の組換えAAVベクターを用いた運動ニューロンの割合が高い形質導入するために利用されています。

ICV注入時の最も重要な考慮事項は、針の先端の長さを伴います。先端には十分な長さは、頭蓋骨の2 mm以上に浸透できるようにする必要があります。先端の長さが足りない場合、針は効率的に心室に入ることができなくなります。先端が長すぎるとまた、、これは、注入する溶液の取り込みを阻害し、また、頭蓋骨を介して正しく導くことが困難な壊れやすいヒントを作成します。針の角度は、矢状縫合に向かって先端が頭蓋骨に垂直に保持することによって心室に正確な浸透性を確保することが重要です。 ICV注射は、病気のマウスモデル^4,9-17のCNS ​​への化合物、薬剤、治療RNAは、プラスミドDNA、およびウイルスベクターを導入する多くの研究に利用されている。しかし、ICV注入の制限要因は、治療薬の必要なボリュームの浸透が認められない新生児マウスの脳室の小容量です。そのため、短期間で低ベクトル用量を用いて治療発現レベルに到達する能力は、吐出量が制限されている場合、特に重要です。