La entrega de los agentes terapéuticos a través de intracerebroventricular (ICV) y la inyección intravenosa (IV) en ratones

1. Inyección intracerebroventricular

1. El primer paso es la preparación de las soluciones de inyección de valores, estas soluciones son vector viral, el ADN plásmido, las drogas, y debe ser inyectado bajo condiciones estériles.
2. Mezcla de un título deseado de vector viral (total l 5-7) con un 0,05% w / v de azul tripan en PBS durante la visualización del sitio de la inyección.
3. Solución de ADN plásmido (5 en total l l) contiene D-(+)-glucosa al 20% (w / v) (1 l), azul de tripano (0,05%) PBS (1 l), el plásmido (~ 5 ~ g / L ~ ) (2 ~ L), y 2,5 kDa homopolímero lineal PEI (150 mm) (1 ~ L).
4. Inmovilizar el PND dos recién nacidos a través de la crio-anestesia durante 1-2 minutos.
5. La aguja utilizada para la inyección es un micro-litros calibrada micropipeta de vidrio esterilizado que se adjunta a una jeringa de 3 ml 3 ml Hamilton a través de un tubo largo.
6. Romper la punta de la aguja (con una espátula) para ajustarse a la penetración de 2 mm en el cráneo. Colocar la aguja en diagonal en el tubo de microcentrífuga que contiene la solución inyectable. Cargue la solución de la inyección en la aguja con cuidado tirando del émbolo de la jeringa.
7. Después de la absorción de la solución, desvincular la jeringa de la sonda, tire del émbolo hasta allá y luego se adhieren a la aguja de nuevo.
8. Mantenga la aguja en la mano derecha entre el pulgar y los dedos índice y coloque la jeringa entre los dedos medio y anular con el émbolo tocando la palma de la mano derecha.
9. Sujete firmemente el ratón inmovilizado por la piel detrás de la cabeza con la mano izquierda y colocar en una luz de fibra óptica para iluminar las estructuras anatómicas relevantes que se pueden utilizar como guía.
10. Inserte la aguja de 2 mm de profundidad, perpendicular a la superficie del cráneo, en un lugar de aproximadamente 0,25 mm lateral a la sutura sagital y 0,50-0,75 mm rostral a la sutura coronaria neonatal (Figura 1). A continuación, empuje el émbolo con la palma de la la mano derecha muy despacio y con cuidado. Monitor de ruptura de vasos o hinchazón de la cara.
11. Retire la aguja de 15 segundos después de la interrupción del movimiento del émbolo para evitar el reflujo.
12. Para recuperar, mantener a los ratones durante 5-10 minutos en un recipiente calentado hasta que el movimiento y la respuesta general es restaurado.

2. La inyección intravenosa a través de la vena temporal / facial

1. La solución a inyectar debe estar preparado y que será completada con el tinte filtra los alimentos verdes en dilución 1:100 y se inyecta bajo condiciones estériles.
2. Adjuntar una pequeña de plástico luer hasta el final de una jeringa de vidrio de 100 L Hamilton. Para el luer, conectar un 33 calibre 0,25 pulgadas aguja hipodérmica. Asegúrese de que todas las piezas estén bien conectados.
3. Cargue la jeringa con el volumen a inyectar, asegurando que no hay aire en la jeringa como la inyección de aire en el vaso es letal. A menudo es útil para pipeta el volumen que se inyecta a un trozo de parafilm. Esto permite la visualización clara de la absorción de la solución en la jeringa.
4. A la vista Transiluminador Wee se utiliza para visualizar fácilmente la vena temporal superficial, o en la vena facial, en el neonato (Figura 2A). Antes de la inyección, seguro del recién nacido a la transiluminador con cinta quirúrgica. Gasa se debe colocar entre el recién nacido y la cinta para evitar que la cinta de dañar la piel del animal. Seguro que el animal el transiluminador de su lado, asegurando que la cinta no impide la respiración. El cuello del recién nacido debe ser agitado giró de forma que la vena facial es fácilmente visible y la nariz debe ser grabada para estabilizar la cabeza.
5. Usando una lupa diadema 2,25 X para permitir una mejor visualización, introduzca lentamente la aguja en la vena. La vena es muy superficial por lo que la aguja debe permanecer visible debajo de la piel.
6. Poco a poco infundir el volumen de la solución en la vena. El tinte verde permite una fácil visualización de la inyección.
7. Espere 15 segundos antes de retirar la aguja, como hay un desfase entre completamente el émbolo de la jeringa y la expulsión de la solución restante debido a la perforación de aguja extremadamente estrecho.
8. Después de retirar la aguja, usar una gasa para aplicar presión en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene.
9. Monitorear el recién nacido en busca de signos de angustia. Después de una inyección adecuada, no angustia manifiesta deben ser observados. El recién nacido debe ser dado a unos 5 minutos para recuperarse antes de que sea devuelto a la jaula.
10. Enjuague la unidad de la aguja / jeringa con PBS entre las inyecciones de la sangre en la aguja rápidamente se obstruyen debido al pequeño diámetro.

3. Los resultados representativos:

ICV inyección: El cerebro se puede cosechar en el momento de los diferentes puntos después de la inyección y se visualizan para demostrar la técnica de inyección de éxito. Si el medio no se agrega a la solución de inyección, que será difícil para verificar la exactitud de los deproyección. De inyección adecuada de uno de los ventrículos permite la distribución de los azules en el lado de tripan inyecta en el cerebro a unos 10-15 minutos después de la inyección (fig. 1B). Una distribución uniforme de azul tripán en ambos hemisferios cerebrales derecho e izquierdo y bulbos olfatorios será visible aproximadamente 60 minutos después de la inyección (fig. 1C). Esto se debe a la conectividad de los ventrículos cerebrales que permitan la difusión del colorante azul al ventrículo adyacente. Inyecciones de precisión también puede verse por la dispersión del colorante azul en el canal central de la columna rostral aproximadamente dentro de 12 horas después de la inyección (Figura 1D). Inyecciones incorrectas pueden ser distinguidos por la falta de color azul en los hemisferios cerebrales. En este caso, la profundidad de la aguja no fue suficiente y la solución de inyección probablemente ha distribuido bajo la piel. Una posibilidad alternativa es que la aguja penetra demasiado profundamente en el cerebro, lo que pasa más allá del ventrículo y la solución se vacía por debajo de los ventrículos cerebrales.

IV de inyección: inyección precisa y eficiente la vena temporal / facial puede ser visualizado inmediatamente después de la inyección. Como la solución se inyecta el tinte verde permite la visualización de la solución que entra y fluye a través de la vena facial (Figura 2A). Además, el color de la piel alterada del ratón se observó después de la inyección. El recién nacido es de color rosado normal se convierte en verde, debido a la presencia del colorante verde en la solución de la inyección (Figura 2B). La medida del cambio de color verde observada en el recién nacido depende de la concentración de colorante utilizado. Para la visualización simple de la inyección y durante un periodo de prácticas, una dilución 1:50 se recomienda. Sin embargo, el tono de la piel dramáticamente alterado con frecuencia resulta en el cachorro de ser rechazado por la madre y por lo tanto, la eliminación del colorante o una concentración significativa reducción se debe considerar en los procedimientos experimentales. Una inyección incorrecta dará lugar a la acumulación de colorante verde debajo de la piel en el sitio de la inyección. Inyección incompleta, lo que ocurre cuando la abertura de la aguja no está completamente insertada en la vena, se ve cuando los flujos de alguna solución en la vena y algunos se acumula bajo la piel. Si esto se detecta, la aguja debe insertarse aún más en el vaso.

Figura 1. Demostración del éxito de las inyecciones de ICV en PDN2 ratones. Un esquema) de los sitios de inyección utilizado en las inyecciones ICV hacia los ventrículos. B) del cerebro de ICV inyecta Cachorro con azul tripán en PBS el ventrículo izquierdo, foto tomada 15 minutos después de la inyección. C ) del cerebro de ICV inyecta Cachorro con azul tripán en PBS en ventrículo izquierdo, foto tomada 60 minutos después de la inyección. D) se muestra el centro del canal espinal rostral de ICV inyecta cachorro con azul tripán en PBS el ventrículo izquierdo, foto tomada 12 horas después de la inyección.

Figura 2. Demostración del éxito de inyecciones intravenosas en PDN2 ratones. Esquema A) de la vena facial utilizada para inyecciones intravenosas. B) IV Cachorro inyectó un tinte verde en comparación con PBS sin inyección de la misma camada, foto tomada inmediatamente después de la inyección.

Investigación utilizando modelos de ratón de la enfermedad a menudo requiere la administración de medicamentos u otras sustancias a los recién nacidos. En este video, se demuestra el paso a paso los procedimientos que participan dos tipos de estrategias de inyección que puede ser utilizada para combatir el SNC: 1) la inyección directa en el sistema nervioso central que utilizan intracerebroventricular (ICV) de la inyección, o 2) la inyección IV dirigidas a la / temporal vena facial. El calendario de estas inyecciones es de gran importancia. Dado que las inyecciones ICV son a mano alzada, el cráneo debe ser relativamente maleable. Este tipo de inyección sólo es posible a través de la primera semana de vida, y se vuelve cada vez más difícil y perjudicial para los animales como la edad de los animales. Sin embargo, el principal beneficio es que la entrega directa al SNC se logra, efectivamente sin pasar por la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, si un investigador es el desarrollo de la terapéutica del SNC, es posible analizar los compuestos que no están completamente optimizados para los fármacos de propiedades tales como la permeabilidad de la barrera sanguínea del cerebro, sin embargo, la actividad de compuesto se puede medir en las correspondientes enfermedades tejidos. El uso de la vena temporal durante los primeros días de vida ha demostrado su utilidad, ya que es una técnica relativamente no invasiva para la Administración General IV. En esta etapa de desarrollo, sin vetas adicionales son fácilmente accesibles, tales como la vena de la cola que se hace más accesible durante la segunda semana de la vida ^5. Tanto las técnicas de inyección son seguros y se puede realizar a mano alzada, con la recuperación de ratones poco después de la inyección, sin efectos secundarios perjudiciales. Ambas técnicas son adecuadas para la inyección rápida de un grupo de animales en un período corto de tiempo. Que requieren la visualización adecuada de la zona en cuestión para asegurar una inyección de éxito. Esto está previsto por el transiluminador y la diadema de aumento en la inyección intravenosa (Tabla 1) y una luz de fibra óptica en la inyección ICV.

Una de las ventajas de la inyección IV es que un mayor volumen (100 Ll ∞) puede ser inyectado con ~ 90% de éxito ^6. Los problemas más comunes encontrados al aprendizaje de la técnica IV incluyen mala colocación de agujas que resulta en inyecciones subcutáneas y / o inyecciones incompleta. Estos problemas pueden ser contrarrestados por asegurar que el bisel de la aguja está bien pasa a través de la embarcación. La aguja debe insertarse en el vaso lo suficiente para que el bisel de la aguja está completamente rodeada por el buque. Además, el barco es muy superficial, por tanto, la inyección debe asegurarse de que la aguja está en el barco y no debajo de ella. Para comprobar si la aguja está en el barco, después de la colocación de la aguja se mueve suavemente de lado a lado. Si la aguja ha penetrado en el barco, el barco se moverá junto con la aguja. Si el barco no se mueve, la aguja no se inserta correctamente. Realizar esta comprobación antes de la inyección se incrementará el número de inyecciones con éxito. La entrega de Neonatología del AAV9 vectores ha sido recientemente utilizada con éxito para la transducción de un alto porcentaje de las neuronas motoras utilizando vectores AAV recombinante en ^7,8 ratones SMA.

La consideración más importante durante la inyección ICV refiere a la longitud de la punta de la aguja. La punta debe ser lo suficientemente largo de modo que pueda penetrar por lo menos 2 mm en el cráneo. Si la punta no es suficiente, la aguja no se podrá entrar de manera eficiente hacia los ventrículos. Por otra parte, si la punta es demasiado largo, lo que dificulta la absorción de la solución para ser inyectada y también crea una punta frágil que es difícil para guiar correctamente a través del cráneo. El ángulo de la aguja es importante para asegurar la penetración exacto en el ventrículo mediante la celebración de la perpendicular a la cabeza con la punta hacia la sutura sagital. Inyecciones ICV se han utilizado en numerosos estudios para introducir compuestos, las drogas, ARN terapéutico, ADN plásmido, y vectores virales en el SNC de los modelos de ratones enfermos ^4,9-17. Sin embargo, el factor limitante en la inyección ICV es la poca capacidad del ventrículo cerebral en ratones recién nacidos que no pueden permitir la penetración de un volumen deseado de los agentes terapéuticos. Por lo tanto, la capacidad de alcanzar niveles terapéuticos expresión que utiliza una dosis más baja de vectores en un corto período de tiempo es particularmente importante cuando el volumen de suministro es limitado.