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 JoVE Neuroscience

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

1, 1, 2, 1

1Center for Integrative Genomics, University of Lausanne, 2Department of Biology, University of Konstanz

Article
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    Summary

    Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de vida

    Date Published: 3/14/2012, Issue 61; doi: 10.3791/2976

    Cite this Article

    Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (61), e2976, doi:10.3791/2976 (2012).

    Abstract

    El lóbulo antenal es el principal centro olfativo en el cerebro del insecto, y representa el equivalente anatómico y funcional del bulbo olfatorio de vertebrados 1-5. Información olfativa en el mundo exterior se transmite hasta el lóbulo antenal por las neuronas sensoriales olfativas (OSN), que segregan a regiones distintas de neuropilo llamados glomérulos de acuerdo con el receptor específico olfativa que expresan. En este caso, OSN axones hacen sinapsis con dos interneuronas locales (LN), cuyos procesos pueden inervar muchos glomérulos diferentes, y las neuronas de proyección (SNP), que transmiten la información olfativa a las regiones superiores del cerebro olfativo.

    Imágenes ópticas de la actividad de la OSN, LNS y RdP en el lóbulo antenal - Tradicionalmente, la utilización de indicadores sintéticos de calcio (por ejemplo, calcio verde, FURA-2) o sensibles al voltaje colorantes (por ejemplo, RH414) - ha sido durante mucho tiempo una técnica importante para entender cómo olfativa estímulos se representan como patrones espaciales y temporalesde la actividad glomerular en muchas especies de insectos 6-10. Desarrollo de organismos genéticamente codificados en la prensa de la actividad neural, tales como los indicadores de calcio fluorescentes G-CAMP 11,12 y 13 Cameleon, el indicador de calcio bioluminiscente GFP-aequorin 14,15, o un reportero de la transmisión sináptica, synapto pHluorin-16 ha hecho que el sistema olfatorio de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular acceso a las imágenes neurofisiológico, como complemento de sus ampliamente descritas las propiedades moleculares, electrofisiológicas y neuroanatómicas 2,4,17. Estos reporteros se expresa selectivamente a través de sistemas binarios de control de transcripción (por ejemplo, GAL4/UAS 18, la serie LEXA / LexAop 19,20, sistema de Q 21) en poblaciones definidas de neuronas dentro del circuito olfatorio para diseccionar con alta resolución espacial y temporal de la forma de olor evoca la actividad neuronal está representado, modularse y transformarse 22-24 </ Sup>.

    Aquí se describen los métodos de preparación y análisis para medir el olor de respuestas evocadas en el lóbulo antenal Drosophila usando G-CAMP 25-27. La preparación de los animales es mínimamente invasivo y se puede adaptar a las imágenes de campo amplio uso de microscopios de fluorescencia, confocal y dos fotones.

    Protocol

    1. Bloque de montaje de la Asamblea

    1. El bloque de plexiglás de montaje (Figura 1A), debe hacerse según las especificaciones exactas que figuran en el proyecto (disponible en
      http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) Para permitir un fácil montaje y la disección de la mosca. Hilo a través de los tornillos de la parte posterior, pero no los extenderse más allá de la parte frontal del bloque; su posición se ajusta durante la preparación del animal (véase 2,7).
    2. Usando un taladro de precisión, hacer mella en el borde superior de la cámara circular de la marcha, excavación debajo de la superficie para hacer espacio para el cuerpo de la mosca, reduciendo el espesor del bloque en este punto.
    3. Cortar una rejilla de cobre con un bisturí perpendicular y cerca de la parte inferior de la rendija para crear un "cuello". Asegúrese de que los dos colgajos resultantes están al mismo nivel, ya que esto ayudará a la inserción de la marcha.
    4. Con un palillo de dientes, coloque una pequeña gota de pegamento en el bloque de montaje por encima de la cámara circular de la marcha. Colocar la rejilla de cobre en la cola y la posición de modo que la hendidura se centra en el bloque (Figura 1A). Presione con suavidad y eliminar cualquier exceso de pegamento. Con un par de pinzas, añadir pequeñas gotas de pegamento en las lengüetas de cada lado y doblar la rejilla en la parte frontal del bloque de manera que la ranura esté apuntando directamente hacia abajo. Asegúrese de que la parte superior de la red es el nivel con el bloque. Deje que se seque por completo.
    5. Montaje de un soporte de alambre: cortar un cubreobjetos de plástico por la mitad y quitar una pieza central para hacer una "U". Use cera para pegar un pedazo de alambre en la parte superior de la "U", no hacen el alambre demasiado tenso.
    6. Construir el escudo antenal: hacer un agujero en un cubreobjetos de plástico con un documento del taladro. Recortar los bordes del cubreobjetos a 0,5 x 0,7 cm. Pegue el cubreobjetos perforado de plástico para cinta adhesiva y luego coloque una gota de etanol en la cinta expuesta a través del agujero deretirar el adhesivo.

    2. Preparación de Animales

    1. Las moscas de los genotipos adecuados-es decir, teniendo la combinación deseada de "conductor" y los transgenes reportero actividad - debe ser de 1-3 semanas de edad, la cutícula de las moscas más jóvenes es demasiado blanda y difícil de cortar. Cuando los experimentos requieren una comparación directa de diferentes genotipos, y con el fin de igualar los niveles de expresión del transgen, las moscas deben ser emparejados por edad para evitar relacionadas con la edad las diferencias fisiológicas. Si el género no es importante, se prefiere usar las moscas hembras, ya que tienen cabezas más grandes y son más fáciles de manipular.
    2. Anestesie moscas por enfriamiento en hielo.
    3. Introducir una sola mosca en el bloque de montaje. Mantener la marcha por la articulación del ala y deslícela, dorsal primera superficie, a lo largo de la hendidura de la rejilla de cobre de manera que está suspendido por su cuello (Figura 1B-C). Si es necesario, girar hasta que está mirando hacia abajo.
    4. Colocar una espina de cactus fino delante de la fly la cabeza para evitar que se escape (Figura 1B-C). Colocar la columna cactus en frente de la trompa para evitar que se mueva. Fijar la espina de cactus al bloque con cera de abejas. Asegurarse de que la parte superior de la cabeza esté a nivel con la parte superior del bloque.
    5. Fijar la cabeza de la mosca de la manzana con una pequeña gota de resina (en etanol). Coloque el bloque en una caja humidificado y permitir que la colofonia se endurezca durante aproximadamente una hora.
    6. El uso de pinzas, tire de la placa antenal hacia delante y colocar el cable en el soporte (cera del lado de fuera, ver 1.5) en el pliegue cuticular entre la antena y la cabeza. Fije el soporte a la parte delantera del bloque con cera de abejas.
    7. Con los tornillos integrados en el bloque, empuje suavemente el soporte de alambre hacia adelante para crear un poco de espacio entre la placa de antena y la cabeza.
    8. Coloque el protector antenal (véase 1,6) sobre la parte superior de la cabeza de la mosca con el orificio de posicionado centralmente. Fijar con cera de abejas a la parte superior del bloque de montaje.
    9. Utilizando una cuchilla-splitter, cuagujero ta pequeña en la cinta sobre el escudo exponiendo la cutícula de la cabeza de la mosca detrás de la antena. El agujero no debe extenderse más allá de los ojos para evitar la preparación de fugas.
    10. Selle el agujero entre la cinta y la cutícula con silicona de dos componentes. Elimine cualquier exceso de silicio de la parte superior de la cabeza de la mosca.
    11. Colocar una gota de solución salina (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2, 2 mM de CaCl 2, 36 mM de sacarosa, 5 mM HEPES, pH 7,3) en la cabeza de Drosophila Ringer. Asegúrese de que no hay fugas: las antenas deben permanecer completamente secos. Usando una hoja de zafiro, un agujero en la cutícula. En primer lugar, la ligera puntuación a lo largo del pliegue cuticular directamente detrás de la antena, luego se corta a lo largo de los ojos y en todo el ocelos en la parte posterior. Finalmente, doble la pieza de la cutícula en el borde marcado y corte de la parte inferior para evitar la ruptura de los nervios antenales.
    12. Retire con cuidado las glándulas y la tráquea con unas pinzas finas. Enjuagar varias veces con Drosophila

    3. Olor de entrega de estímulo

    1. Jeringas de olor: insertar una almohadilla de celulosa en una jeringa de plástico de 2 ml con pinzas limpias y pipeta sobre ella (utilizando puntas de filtro) 20 l de olor, diluidas como se desee en un disolvente apropiado, utilizando la punta de la pipeta para empujar la almohadilla profundamente en el barril . Enchufe y la tapa de la jeringa hasta que sea necesario. Diluciones frescas de olor debe estar preparado por lo menos cada 3 meses (o más frecuentemente por los olores altamente volátiles y / o de uso frecuente), y nuevas pastillas deben estar preparados para las jeringas olor justo antes de cada sesión de grabación. No utilice almohadillas de olor durante más de tres estímulos, ya que la concentración de olor podría decaer.
    2. Personalizados hechos olfatómetro (Figura 2): una corriente de aire primaria (1 l / min) se dirige a través del tubo de teflón (0,4 mm de diámetro interno); 27 cm aguas arriba de la salida de este tubo, una corriente de aire secundaria (1 l / min ) se añade. Ambas corrientes de aire son generadas por las bombas de membrana, yla velocidad de flujo se regula por dos caudalímetros independientes. Las corrientes de aire pueden ser humidificada al pasar a través del agua en botellas de lavado de gas, aunque se debe tener cuidado para evitar un exceso de humidificación (es decir, más de ~ 60%). La corriente de aire secundaria es dirigido o bien a través de una jeringa olor o una jeringa vacía: jeringas están conectadas a la corriente de aire a través de una aguja de la jeringa (1,2 mm de diámetro exterior) perforar el émbolo. Una válvula magnética de tres vías controlado a través de una unidad de controlador de la válvula (por ejemplo VC6 Harvard Apparatus) se utiliza para conmutar entre el aire limpio y estímulo olor.

    4. Imágenes in vivo

    1. Se describe aquí la imagen usando un microscopio de fluorescencia en posición vertical (por ejemplo, en posición vertical fija la etapa Zeiss Axio Examiner D1) equipado con un objetivo de 20x del agua (por ejemplo, Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x / 1,0 DIC M27) ​​(Figura 2). Para imágenes con G-CAMP (excitación / emisión: 488/509 nm), utilice un filtro de bloque con las siguientes propiedades: 450-490 nm de excitación del filtro, Espejo dicroico (T495LP) y 500-550 nm de emisión de filtro (Chroma ET). Coloque el bloque de montaje que contiene la marcha bajo el microscopio. Coloque la salida del olfatómetro de aproximadamente 0,5 cm por delante de las antenas de la mosca.
    2. Baje el objetivo hasta que toque la solución de Ringer sobre la cabeza de la mosca. Mirando a través del visor bajo iluminación de campo claro, la posición de la preparación de modo que el agujero en la cápsula de la cabeza está centrada y sus bordes están en el foco. Cambie a la luz fluorescente y ajustar el enfoque hasta que pueda ver las neuronas marcadas (evidentes a partir de la fluorescencia basal de color verde del G-CAMP).
    3. Enfoque fino de los glomérulos de interés por la adquisición de imágenes con un dispositivo de carga acoplada (CCD) de la cámara (por ejemplo, CoolSNAP-HQ2 sistema de cámara digital) montado en el microscopio utilizando software de adquisición apropiado (por ejemplo Metafluor) (Figura 3). Cierre el diafragma en el camino de iluminación de luz para limitar la luz de excitación en el área observada.
    4. Para la grabación de olor evocaactividad, establecer la velocidad de adquisición de 4 Hz y ajustar el tiempo de exposición para obtener valores de fluorescencia en el rango dinámico de la cámara CCD, pero no inferior a 1000 (unidades arbitrarias), con al menos 12-bits de resolución dinámico. El tiempo de exposición no debe superar los 100 ms, si es posible, para reducir el G-CAMP photobleaching Si la resolución espacial de la cámara lo permite, se puede aumentar el hurgar en la basura (el número de pozos en el chip que será agrupada en un solo píxel digital) para reducir el tiempo de exposición. Se obtienen imágenes de 350x225 píxeles (con un binning de 2x2), que corresponden a 210x135 micras, con la preparación. Estos valores son óptimos para capturar glomerulares inducidas por el olor de las respuestas del G-Camp con buena resolución espacial y temporal limitando al mismo tiempo reportero de blanqueo.
    5. Establezca los parámetros de medición. Por lo general grabar durante 10 segundos (es decir, 40 fotogramas), con la estimulación olor generalmente a partir de 4 segundos después del comienzo del período de adquisición (estructura 15) y una duración de un segundo (uasta marco de 19). Una preparación volar normalmente se puede probar con un máximo de 25-30 estímulos de olor diferentes, a menudo limitadas por un declive irreversible en la señal fluorescente del reportero, debido a photobleaching. El intervalo entre estímulo dependerá de la fuerza de la respuesta observada y la tasa de photobleaching. La duración apropiada del intervalo entre estímulos para evitar la adaptación sensorial se puede determinar de forma aproximada por la presentación repetida de un olor de control positivo (si se conoce) en los experimentos de prueba. La inclusión de este olor cada ~ 10 estímulos de una misma serie puede permitir la verificación de la viabilidad y capacidad de respuesta uniforme de la preparación.

    5. Procesamiento de Datos y Análisis

    Los datos se procesan utilizando ImageJ (con Mac biofotónica plug-in, www.macbiophotonics.ca ) y la costumbre de los programas escritos en Matlab y R de la siguiente manera:

    1. Corregir los artefactos de movimiento de muestra:alinear todas las imágenes correspondientes a la preparación de un animal (por ejemplo, 30 mediciones de 40 fotogramas cada uno) a través del "cuerpo rígido" modo de StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg ) en ImageJ. Este paso es necesario para eliminar los cambios en la posición de las neuronas marcadas con respecto al bastidor adquisición dentro y entre las medidas. Sin embargo, sólo es posible eliminar los cambios en el plano xy. Los datos deben ser descartados si los cambios se producen fuertes en el enfoque.
    2. Segmento de la pila en las mediciones individuales de 10 segundos (40 cuadros).
    3. Correcta para el blanqueo de los artefactos: la exposición a la luz fluorescente hará que la fluorescencia de la corrupción durante una medición única de 10. En algunos casos, es importante para corregir este deterioro antes de analizar los datos. Para cada medición calcular un marco de fondo. Esta debe ser la media de varios fotogramas antes del inicio del estímulo (por ejemplo, cuadros 6-14). Divida cada fotograma de este backgredondear marco para obtener los cambios de fluorescencia relativa. Calcular el valor medio de fluorescencia relativa de cada fotograma por un promedio de todos los píxeles dentro del área marcada por el G-CAMP. Colocar un doble exponencial a la curva de fluorescencia media, dando un peso mayor a los cuadros anteriores al estímulo y el peso cero a la hora de la respuesta olor (20 cuadros después de la aparición de estímulo en nuestro caso). Restar la curva ajustada de la curva de fluorescencia relativa de cada píxel. Multiplicar los marcos corregidos por el bastidor de fondo para volver a obtener los datos en bruto. Este tipo de corrección puede conducir a una modificación en la dinámica de respuesta si la señal no retorna a la línea de base por el final de la medición (por ejemplo, si las respuestas excitadoras inhibitorios o muy fuerte son evocados) (Figura 4). Mientras que la corrección de artefactos de blanqueo es útil en muchos casos, la interpretación de los parámetros temporales debe hacerse con precaución si la corrección se aplica cloro.
    4. Calcular el cambio relativo de la fluorescencia (y Delta, F / F) para cada fotograma de cada medición, (F i F-0) / F 0 * 100, donde F 0 es el marco de fondo (ver sección 5.3), y M i el valor de fluorescencia para el marco de la i-ésima la medición.
    5. Calcular la media Df / F dentro de una región circular de interés en un glomérulo (Figura 3B) con un diámetro de 10 pixeles para obtener rastros de actividad (Figura 5A). Si lo desea, transformar estos restos en mapas de calor utilizando ImageJ (Figura 5).
    6. Calcular la amplitud del pico de la respuesta al restar la media Df / F de cuatro cuadros antes de la estimulación de la media Df / F de cuatro marcos durante el pico de la respuesta. El mismo procedimiento se utiliza tanto para ilustrar los patrones espaciales de respuesta (véase la Figura 3B) y para cuantificar la amplitud de la respuesta en las regiones específicas de interés a través de las moscas (ver Figura 5B). La respuesta de pico también se puede cuantificar mediante la integración del área bajo la curva durante el tiempo del estímulo, o averaging los marcos alrededor de la máxima de la respuesta.

    6. Los resultados representativos

    Se utilizaron los protocolos anteriores para registrar y analizar las respuestas evocadas propiónico ácido de las moscas que expresan G-28 CaMP1.6 bajo el control del promotor para el co-receptor olfatorio IR8a, que es activo en varias poblaciones diferentes de la OSN (29,30 Las figuras 3-5). La estimulación con 1% de ácido propiónico provoca incrementos en G-CAMP fluorescencia - indicando aumentos en el calcio intracelular - en OSN inervan dos glomérulos, DC4 y DP1l (Figura 3B). Nos ilustran diferentes maneras de representar los datos de las moscas múltiples en la Figura 5: rastros de la línea de actividad, Heatmaps y una parcela de la barra de respuestas de los picos. Las respuestas evocadas por propiónico tienen diferentes amplitudes de pico y las dinámicas temporales en DC4 y DP1l. Además, aunque las respuestas son generalmente robusto, la variabilidad entre animales individuales también puede observarse tanto en glomérulos (véase élatmaps en la figura 5A). Cuantificación de las respuestas de los picos (Figura 5B) permite una simple comparación estadística entre glomérulos diferentes y odorantes diferentes a través de los animales. Sin embargo, el olor de respuestas evocadas de calcio puede tener la falta de uniformidad dinámica temporal, y cuantificar su magnitud, con un solo valor no tendrá en cuenta esta complejidad.

    Figura 1
    Figura 1. Esquema del bloque de montaje (A) antes y después (B) la introducción de la mosca, y (C) una vista superior en primer plano (adaptado de 31).

    Figura 2
    Figura 2. Esquema del montaje experimental.

    Figura 3
    Figura 3. (A) Vista superior de la preparación de vuelo después del paso 2.8 (panel izquierdo) y la imagen cruda de fluorescencia de la apuestalóbulos NNAL etiquetados con el G-CaMP1.6 (Genotipo: promotor IR8a: GAL4, UAS: G-CaMP1.6). DC4 y glomérulos DP1l se pueden distinguir por su morfología, tamaño y posición y están marcados en rojo y azul, respectivamente.
    (B) con código de colores de la imagen de la respuesta al ácido propiónico (1% v / v). La imagen corresponde a la Df / F del pico de la respuesta calculada como se explica en el paso 5,6 (véase también la Figura 5A). El ColorScale a la izquierda indica el% Df / F de valor. Los círculos negros indican la posición y el tamaño de la región de interés utilizado para cuantificar las respuestas (ver Figura 5).

    Figura 4
    Figura 4. Corrección de blanqueo de la señal fluorescente reportero. Los ejemplos del efecto de la corrección de cloro como se describe en el paso 5,3. Los datos de muestra en el panel izquierdo se puede corregir sin grandes cambios en la forma de la respuesta. Los datos de muestra en el panel derecho se afectan gravementeed por la corrección de cloro, probablemente debido a que la señal desaparece y se mantiene por debajo de línea de base después de la terminación olor estímulo.

    Figura 4
    Figura 5 (A) superior:. Dinámica temporal de las respuestas de calcio de los glomérulos DC4 (izquierda) y DP1l (derecha) para el ácido propiónico (1% v / v). Las huellas negras muestran la mediana de la media Df / F en la región de interés (véase la Figura 3B) a través de ocho animales. La superficie gris indica el rango entre los primer y tercer cuartil de la distribución. Presentación de los valores de la mediana y el cuartil proporciona más información sobre la variabilidad y la distribución de las respuestas observadas a media y error estándar. Las cajas verdes y magenta indican los marcos promedian para calcular las respuestas de los picos mostrados en la Figura 3B, y se cuantifica en la Figura 5B. Abajo: los mapas de calor muestran los datos de respuesta para todos los animales individuales en filas separadas, con Df / F los valores represented por el ColorScale (extrema derecha). Las barras negras horizontales indican la hora y la duración del estímulo. (B) La mediana de respuestas de los picos de ácido propiónico a través de ocho animales para DC4 y glomérulos DP1l. Las barras de error indican el intervalo entre primer y tercer cuartil de la distribución.

    Discussion

    Los métodos de preparación y análisis descritos aquí se pueden utilizar para analizar los olores de respuestas evocadas en una población de neuronas en el lóbulo antenal (OSN, LN y PN) para los que un transgén de conducir correspondiente está disponible. Mientras que se describe su aplicación mediante un microscopio de fluorescencia, imágenes ópticas de esta preparación igualmente se puede realizar utilizando microscopía confocal o dos fotones 22,32. De hecho, estos últimos instrumentos aliviar el problema de dispersión de luz de amplio campo de la microscopía, que puede reducir la resolución de las imágenes, especialmente cuando un gran número de neuronas expresa del reportero. Esta preparación por lo general permite grabaciones de olor de respuestas evocadas por lo menos durante media hora, pero esta vez puede ser significativamente más larga o más corta dependiendo de la cantidad y la duración de las mediciones registradas, el tiempo de exposición para cada cuadro y el intervalo entre estímulos. Por otra parte, la excitación de dos fotones puede reducir photobleaching de la representante de fluorescentesorter, así como fototoxicidad celular, para permitir la medición durante períodos de tiempo más largos 22,32.

    Independientemente de la elección del microscopio, el movimiento del cerebro de la mosca dentro de la cápsula de la cabeza es el problema más recurrente cuando la imagen en animales intactos. Mientras que la corrección de movimiento puede corregir problemas menores (paso 5.1), por lo general es mejor sólo para grabar a partir de preparaciones de gran estabilidad. Las estrategias para reducir los artefactos de movimiento incluyen: (i) debidamente limitar la probóscide de la mosca con la espina de cactus, (ii) la inmovilización de las piernas de la mosca por su fijación en el escenario con eicosano (antes de la etapa 2.6) (eicosano pueden ser disueltos a ~ 37 ° C, use un alambre de plata para ampliar y afinar la punta del soldador para este propósito), (iii) hacer muescas en el esófago (visible entre los nervios de las antenas) con unas pinzas finas.

    Además de G-CaMP1.6 utiliza aquí, una serie de versiones optimizadas de G-CAMP y otros indicadores de calcio están disponibles,que difieren en su relación señal-ruido, la fluorescencia basal y dinámica temporal 12,28,33. La elección precisa de los sensores deben tener en cuenta todas estas propiedades, el tipo de neuronas a analizar y la cuestión biológica que se aborde. Sensores de corriente de calcio informar de los cambios que se correlacionan bastante bien con los potenciales de acción 12,34, y su mejora, junto con el creciente número de líneas específicas de impulso genético 35 seguirá mejorando el potencial de la imagen óptica de la actividad neuronal en la mosca intacto.

    Disclosures

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgements

    Reconocemos Silke Sachse y Beate Eisermann en el desarrollo de esta metodología, Pablo Traversa para la elaboración de los planos de montaje del bloque y Pelz Daniela para el uso del esquema de la Figura 1. Estamos muy agradecidos a Silke Sachse, Ramdya Pavan y Rafael Rytz de comentarios sobre el manuscrito. R. Bell con el apoyo de una Fundación Boehringer Ingelheim doctorado de Becas. La investigación en el laboratorio de R. Benton es financiado por un Consejo Europeo de Investigación Starting Grant Investigador Independiente y el Swiss National Science Foundation.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Cactus spine Garden center ~7mm long thin, not too flexible
    Rosin String instrument shop
    Two component silicon World Precision Instruments, Inc. KWIK-SIL
    Custom made plexiglass mounting block Blueprints available
    Copper grids Athene Grids G220-5 Normally used for electron microscopy samples.
    Screws Hardware store 2 mm diameter
    Plastic coverslips Plano GmbH L4193 22 X 22 mm
    Soldering iron tips Conrad Electronics 830283-62
    Regulated power supply Conrad Electronics 511407-62
    Thin wire Isabellenhütte Isa-ohm 0.013 mm
    Eicosane Sigma-Aldrich 21,927-4
    Microscope Carl Zeiss, Inc. Axioexaminer D1
    CCD camera Visitron Systems CoolSnap HQ
    Metafluor Visitron Systems Acquisition software
    Monochromator Visitron Systems Visichrome
    Breakable blades Fine Science Tools 10050-00
    Holder for blade World Precision Instruments, Inc. 14134
    Sapphire blade World Precision Instruments, Inc. 500314 Double edged blade 1mm
    Membrane gas pumps KNF Neuberger NMP 830 KVE
    Sapphire blade holder World Precision Instruments, Inc. 500317
    Three way valve Lee Company LFAA1200118H Configuration E
    Rotameter 500 ml/min Analyt-MTC 112-08SA
    Rotameter 5 L/min Analyt-MTC 102-08SA
    Beeswax Siladent Technik 209212
    Cellulose pad Kettenbach 31003
    Tweezers Plano GmbH T5130 Dumont biology #5
    Syringes BD Biosciences 300928 2ml, Discardit II, 2pieces
    Needles Braun Sterican 4665120 1.2mm OD

    References

    1. Galizia, C.G. & Rossler, W. Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function. Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).
    2. Vosshall, L.B. & Stocker, R.F. Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila. Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).
    3. Wilson, R.I. & Mainen, Z.F. Early events in olfactory processing. Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).
    4. Masse, N.Y., Turner, G.C., & Jefferis, G.S. Olfactory information processing in Drosophila. Curr. Biol. 19, R700-713 (2009).
    5. Hansson, B.S. & Anton, S. Function and morphology of the antennal lobe: new developments. Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).
    6. Galizia, C.G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., & Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).
    7. Galizia, C.G., Menzel, R., & Holldobler, B. Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes. Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).
    8. Okada, K., Kanzaki, R., & Kawachi, K. High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain. Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).
    9. Carlsson, M.A., Knusel, P., Verschure, P.F., & Hansson, B.S. Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones. The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).
    10. Galizia, C.G. & Vetter, R.S. In: Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). Christensen, T.A., ed., Ch. 13, 349-392, CRC Press, (2005).
    11. Nakai, J., Ohkura, M., & Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
    12. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
    13. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., & Tsien, R.Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).
    14. Martin, J.R., Rogers, K.L., Chagneau, C., & Brulet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2, e275 (2007).
    15. Murmu, M.S., Stinnakre, J., & Martin, J.R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).
    16. Yuste, R., Miller, R.B., Holthoff, K., Zhang, S., & Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release. Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).
    17. Benton, R. Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception. Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).
    18. Elliott, D.A. & Brand, A.H. The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes. Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).
    19. Lai, S.L. & Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
    20. Yagi, R., Mayer, F., & Basler, K. Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).
    21. Potter, C.J., Tasic, B., Russler, E.V., Liang, L., & Luo, L. The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
    22. Wang, J.W., Wong, A.M., Flores, J., Vosshall, L.B., & Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
    23. Fiala, A., et al. Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons. Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).
    24. Ng, M., et al. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron. 36, 463-474 (2002).
    25. Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56, 838-850 (2007).
    26. Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., & Galizia, C.G. The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a). J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).
    27. Silbering, A.F. & Galizia, C.G. Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions. J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).
    28. Reiff, D.F., et al. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
    29. Abuin, L., et al. Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors. Neuron. 69, 44-60 (2011).
    30. Benton, R., Vannice, K.S., Gomez-Diaz, C., & Vosshall, L.B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136, 149-162 (2009).
    31. Pelz, D. Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. PhD thesis, Freien Universitat Berlin, (2005).
    32. Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
    33. Martin, J.R. In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose? Journal of Neurogenetics., 1-23 (2008).
    34. Jayaraman, V. & Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front. Neural Circuits. 1, 3 (2007).
    35. Pfeiffer, B.D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).

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