Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali

1. Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali

1. Preparazione delle cellule tumorali e cellule endoteliali: le cellule tumorali del cervello, come le cellule U87, B16F1 cellule di melanoma, cancro al seno MDA-MB-435, e le cellule del colon HCT116 sono state coltivate in DMEM supplementato con 10% FBS e la penicillina / streptomicina (tutti da Invitrogen ). Delle cellule endoteliali linea di cellule endoteliali microvascolari (HMVECs) sono state coltivate in EBM2 medio (Lonza) integrata con 1 mg / ml di idrocortisone e 1 ng / ml fattore di crescita epidermico, il 10% FBS e la penicillina / streptomicina. Le cellule sono state lavate con PBS per tre volte e distaccato con 0,05% tripsina / EDTA (Invitrogen). Dopo la centrifugazione con 2.000 rpm per 5 minuti, pellet cellulari sono stati lavati di nuovo con PBS. Poi, le cellule pellet sono stati contati con un emocitometro.
2. Preparazione Matrigel: Una frazione del fattore di crescita ridotto Matrigel (BD Bioscience) è stato riscaldato a temperatura ambiente. Prima di tutto scongelati, è stato trasferito su ghiaccio e il suo liquido è stato tenuto in ghiaccio per almeno 10 min. Di 50 ml di Matrigel è stato placcato da piastre a 96 pozzetti a livello orizzontale che permette al Matrigel per distribuire uniformemente, e incubate per 30 minuti a 37 ° C.
3. Formazione del tubo: Cells (1-2 x 10 ⁴⁾ sono stati nuovamente sospesi con DMEM senza siero per le cellule tumorali o EBM-2 per le cellule endoteliali, e caricate sulla parte superiore del Matrigel. Se questo test è stato utilizzato per misurare gli effetti di alcuni agenti di sviluppo tubulo, questi agenti (stimolatori o inibitori) sono stati aggiunti al mezzo privo di siero. Ogni gruppo condizionale contenute 4-6 pozzi.
4. Immagini e analisi dei dati: A seguito di incubazione a 37 ° C durante la notte, ogni pozzetto è stato analizzato direttamente al microscopio. Se tubuli erano necessari per la fissazione, 100 ml di formalina al 10% salina a base di soluzione è stata gentilmente aggiunto e dieci minuti dopo, era pronta per l'analisi. Sotto un microscopio con contrasto di fase 10x, tubuli in ogni campo sono stati immaginati e una media di tubuli 3-5 campi aleatori in ogni pozzetto è stato contato.

2. Rappresentante dei risultati:

HMVECs sono stati usati come controllo positivo, in quanto tali tubuli sono stati sviluppati da chiare corpi cellulari allungati che si connettono alla rete forma poligonale. Cellule B16F1, U87, e MDA-MB-435 sviluppato tubuli vascolari simili a quelle formate da HMVECs, ma HCT116 cellule non (Figura 1). Una cellula dose-dipendente formazione del tubo è stato testato in U87 cellule. Come dimostrato nella figura 2, 10.000 cellule formano tubuli interrotto. Una volta che le cellule sono state raddoppiate, una solida rete vascolare era paragonabile a quelli osservati in HMVECs. Al contrario, le cellule meno di 5.000 non è riuscito a formare un fenotipo vascolare.

Figura 1. Metropolitana di formazione indotta da HMVECs, U87, MDA-MB-435, e B16F1 cellule, ma non HCT116 cellule. Tutte le cellule (2 x 10 ⁴⁾ sono stati caricati su Matrigel e incubate durante la notte. Tubuli erano ripreso con contrasto di fase. HMVECs sono stati usati come controllo positivo. Un rappresentante di 3-5 campi è stato mostrato. Bar: 100 micron.

Figura 2. U87 cellulare indotta tubuli in un numero dipendente dalla cellula modo. U87 diverso numero di cellule, come indicato negli angoli sono stati utilizzati per la formazione del tubo. HMVECs sono stati utilizzati per un controllo positivo. Bar: 100 mm.

Perché questo test per avere successo, la qualità del Matrigel deve essere testato prima. Un piccolo campione possono essere ottenute presso Bioscience BD per pre-eseguire il test utilizzando HMVECs. Prodotti lotti diversi possono visualizzare qualità dissimili in cui alcuni lotti non forniscono una condizione ottimale per la formazione del tubo. In secondo luogo, tutte le bolle dovrebbe essere evitato quando un'aliquota del Matrigel viene caricato in piastre a 96 pozzetti, perché le bolle possono interrompere la formazione di tubuli. Se bollicine si trovano in un pozzo, il Matrigel può essere immediatamente tornato a tubi Matrigel originale che deve essere tenuto in ghiaccio durante l'esperimento. Inoltre, le cellule testate devono essere mantenuti in un tasso di crescita in una fase di log. Quando tutte le condizioni colto indicando una crescita lenta delle cellule si verificano, devono essere sostituite con cellule sane. Infine, l'analisi di tubi al microscopio dovrebbe essere non più di un'ora se i tubi non sono fissi, perché la temperatura è diminuita (temperatura ambiente) potrebbe influenzare la formazione del tubo. Il test tutto dovrebbe essere completato entro 24 ore per evitare l'interruzione della struttura tubolare indotta da morte cellulare. E 'noto che la formazione del tubo è caratterizzata da molteplici cellulari attivati ​​processi tra cui la migrazione cellulare, l'adesione cellula-cellula, la sopravvivenza e l'apoptosi. Per esempio, la migrazione delle cellule e cellula-cellula adesione sono evidenti durante lo sviluppo del tubo. Dopo 24 ore, tuttavia, l'apoptosi delle cellule significativo avviene come rete interrotto è sempre osservato. Questo evento si verifica in entrambe le cellule endoteliali e cellule tumorali derivati ​​formazione del tubo.

E 'emergenti che questa analisi è fondamentale per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali in vitro, l'evento che è indipendente da cellule endoteliali associate angiogenesi. Qui, abbiamo dimostrato che il melanoma linea cellulare B16F1 e cancro al seno linea MDA-MB-435 reti sviluppate vascolare su Matrigel, coerente con il comportamento vascolare di questi tipi di tumori umani e in modelli animali ^14-17. Anche se il mancato sviluppo di un fenotipo vascolare HCT116 cellule su Matrigel sotto il profilo strutturale sconosciuta, si ipotizza che questa proprietà può essere di tipo vascolare delle cellule tumorali dipendente. Sarebbe interessante sapere se HCT116 cellule non hanno la capacità di generare VM in vivo rispetto a B16F1 e MDA-MB-435 cellule. Pertanto, la creazione di questo saggio è di fondamentale importanza nello studio della biologia del cancro, biologia vascolare, così come lo screening di stupefacenti.