Структура ВИЧ-1 капсида Ассамблеи по крио-электронной микроскопии и итерационных Винтовая реальном пространстве реконструкции

Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction. J. Vis. Exp. (54), e3041, doi:10.3791/3041 (2011).

1. Frozen-гидратированных EM подготовки образцов

Поскольку ВИЧ-1 белок капсида (CA) сборки ⁹ устойчивы лишь в высоких соли (1M NaCl) буфера, что способствует сильный фоновый шум на крио-ЭМ изображений, мы используем быстрого разведения и обратной стороне промокательной метод временно уменьшить соль концентрации при подготовке замороженных гидратированных EM сетки.

1. Тлеющий разряд углерода стороне 200-сетка R2 / 1 Quantifoil сетки меди при 25 мА в течение 25 секунд.
2. Используйте распылитель довести влажность воздуха в экологические камеры, самодельные поршень ручной тяжести, до 80%.
3. В FEI Vitrobot Плунжерные Дьюара, прохладной жидкости этана с использованием жидкого азота. Горы окунуться заморозки Дьюара на ручной поршень тяжести.
4. Применяют 2,5 мкл собранном решение CA на углерод сторону сетки, которая крепится на щипцы, и нагрузка на щипцы поршень с углеродом сторону сетки отворачивается от вас.
5. Добавить 3 мкл буфера низкие разведения соли (100 мМ NaCl) на обратной стороне сетки и сразу промокните обратной стороне сетки с куском фильтровальной бумаги. Вся поверхность задней части сетки должны быть в тесном контакте с фильтровальной бумагой в течение примерно 6 секунд, прежде чем снимать фильтровальную бумагу. Сразу же окунуться в сетку жидкости этана после удаления фильтровальной бумаги.
6. Удалите пинцетом из поршня и быстро перенести сетку в ящик для хранения сетки.

2. Крио-электронной микроскопии CA трубчатых сборки

1. Нагрузка замороженных гидратированных сетку в FEI Polara G2 операционный микроскоп электрона на 200kv и оснащен камерой Gatan 4Kx4K ПЗС.
2. В условиях низкой дозы режим поиска, при увеличении в ~ 200 раз и с дозой <0.001e ^- / A ^2, экран всей сетки для областей с соответствующими льда и сохранить позиции из этих областей в стадии файла.
3. Напомним, сохранили позиции и в дальнейшем экране этих областей при увеличении в 3900 х в низких дозах, в режиме поиска. Выбор районов с равномерным тонким слоем льда, содержащего хорошо разделены, длинные трубки над отверстиями, для сбора данных. Сохранить расположение этих областях в втором файле сцены.
4. Переключение в режим экспозиции при увеличении в 59000 х, вставка 100 мкм апертуре объектива, а также настроить цель stigmatism и интенсивность пучка для дозы ~ 15 е ^- / A ² в экспозиции.
5. Вернуться в низких дозах, в режиме поиска, переход к сохраненной позиции и определить центр и хорошие трубки с помощью камеры CCD. Переключение в режим фокусировки, настроить фокус, и установить расфокусировать значение, как правило, от 0,5 до 2,5 мкм. Переключение в режим экспозиции, установить время экспозиции 0,3-0,5 секунды, при дозе 15 е ^- / A ^2, и собирать изображения. Изображения собраны на тарелку камеры, и фильмы должны иметь возможность поселиться за 10 секунд до воздействия берется.
6. Перейти к следующему сохранено положение и повторите шаг 5, чтобы собрать больше изображений.
7. Фильмы разработаны в полном составе D19 в течение 12 минут и оцифрованных использовании Nikon SUPER COOLSCAN 9000 ED сканер размером пикселя 6,35 мкм. Формат файлов изображений в формате TIFF.

3. Винтовая индексации

Винтовой объект может быть проиндексирован по двум параметрам: Бесселя, п, и слой номер строки, л. Каждый слой линии в преобразование Фурье, характеризуемое (п, л), соответствующий набор линий на поверхности решетки винтовых объект обозначается (А, к) индексах, используя обозначения из 2D решетке. Для любого (А, к), (п _{HK, HK} л) слой линии линейной комбинации двух основных векторов (№ _10, л ₁₀₎ и (п _01, л _01), которые п и л значений две основные линии слоя (1, 0) и (0, 1). л может быть получена из высоты слоя измеряется вдоль линии Z оси преобразования Фурье. Значение п может быть оценена по следующей формуле ¹⁰

πRr ≈ J _н ≈ 1,1 | п | -0,9 .....................( 1)

где J _{п-функции} Бесселя, который определяет интенсивность слой линии ^й п, г-радиус винтовой объекта, а R-радиус максимальной амплитуды слой линии. Число слоев линии, л, связана с п по правилу отбора ¹¹

л = TN + мкм ....................( 2)

где т и и константы спирали. Для любого данного спирали, может быть именно у единиц точно (или очень близко) с тomplete поворотов.

1. Коробка из относительно прямой и длинной трубки с равномерным диаметром с помощью программы EMAN в ¹² helixboxer и ​​сохранить изображение в формате MRC.
2. Определить расстояние винтовой повторяю, с, с использованием кросс-корреляции основан программы, такие как 'imgccf », в пакет MRC ^13.
3. Вычислить преобразования Фурье с новой длины поле, интеграл повторить расстояние, с.
4. Выберите две основные линии слоя, которые определяют две основные векторы поверхностной решетки (1,0) и (0,1).
5. Измерьте радиус трубки, г, а высота и радиус две основные линии слоя в преобразование Фурье, л _10, R _10, L ₀₁ ​​R _01, соответственно (рис. 1).
6. Вычислить N ₁₀ и N ₀₁ в соответствии с уравнением (1).
7. Так как п значения только оценки, несколько комбинаций N ₁₀ и N ₀₁ проходят испытания на последующих этапах (См. шаг 4.2), чтобы найти правильное винтовой симметрии использованием IHRSR программы пакета.
8. Рассчитать винт симметрии описывается двумя вещественными числами: вращение между подразделениями (Δφ) и осевой рост (Δz), с одной-звездочный спирали (п = 1). Учитывая, л _10, л _01, № _10, и N ₀₁ значений, и и т может быть получена путем тестирования диапазон значений м (например, -50 <т <50) в соответствии с правилом отбора. Наконец, Δφ и Δz рассчитываются с использованием Δφ = 360 т / и и Δz = с / у.

4. Трехмерная реконструкция

1. Частица сегментации
   1. Открытое микрофотография содержащих винтовые частиц, используя графический Боксер программа, которая представляет собой программу в пакет EMAN.
   2. Вырезать спиральной частицы на пересекающиеся сегменты. В панели управления Боксер, выберите Helix режим и установить параметры для бокса: размер окна должен быть больше, чем диаметр частиц и значение для 'Olap' должно быть ~ 90% от размера окна.
   3. После левой кнопкой мыши на любом конце спиральной частицы, боксер будет автоматически генерировать серии частиц ящики вдоль спирали длиной.
   4. Сохраните коробку сегментов, а также их координаты.
2. Первоначальные 3D реконструкции с использованием IHRSR программ
   1. Обратить контраст крио-ЭМ изображения и применять фильтрации нижних частот ¹⁴ (опционально) до обработки с итерационным винтовой вещественного метода реконструкции пространства (IHRSR).
   2. Откройте графический интерфейс IHRSR программу, набрав "Генератор". Предоставление графического интерфейса со всей информацией по коробке стек частиц, включая путь и имя стека, число изображений в стеке значения для симметрии параметров и т.д. Нажмите кнопку "Готово", чтобы создать сценарий реконструкции, b25.spi.
   3. Использование твердого или полый цилиндр в качестве начального отсчета и позволяет процедура цикл пока Есть никаких изменений в определенный винтовой симметрии, которое обычно происходит после нескольких циклов. Право винтовой симметрии должно дать стабильно реконструкции конвергентной. Реконструкция генерируется в последнем цикле будет использоваться в качестве начальной ссылки для дальнейшей доработки. IHRSR выполняет 3D-реконструкции с использованием SPIDER программ.
3. Реконструкция с итерационным уточнением ¹⁵ 3D-реконструкции порожденных IHRSR теперь используется как начальная ссылка на дополнительные уточнения. Во время утонченностью, винтовой симметрии фиксируется на Δφ и Δz, которые определяются по процедуре IHRSR.
   1. Определите расфокусировать и астигматизма присутствует в микрофотография с помощью программ CTFFIND3 и CTFTILT ^16.
   2. Умножить частиц сегментов CTF использованием программы СПАЙДЕР ^17. Операция называется FT в СПАЙДЕР набор используется для вычисления преобразования Фурье (БПФ) в 2D-изображения. После этого БПФ умножается на значения CTF, определяется на предыдущих этапах, с помощью операции называется MU, входящее в пакет СПАЙДЕР. Полученное значение затем обратная трансформируется обратно, чтобы сформировать новое изображение (CTF-исправлено) в реальном пространстве, используя СПАЙДЕР операции, FT снова.
   3. Выполните соответствующие проекции, сравнивая проекции ссылкой томов с CTF-исправленной картинки, используя мульти-ссылкой выравнивания. Изменение вне плоскости угол наклона ограничен до + / -10 ° и пробы с шагом в 1 °. Ввести ограничения, такие как высокие коэффициенты корреляции, в плоскости углы около 0 ° или 180 °, и ограниченный х смен, для выравнивания параметров каждого сегмента. Включить в реконструкции только те сегменты, которые удовлетворяют ограничениям.
   4. После каждого итерационного уточнения цикла, 3D-реконструкции создан с помощью обратной проекции и делится на сумму по CTF2.
   5. Вводить винтовой симметрии для генерации симметризованных объема. Итерационного уточнения прекращается при отсутствии дальнейшего улучшения в решении новых 3D-реконструкция происходит.
   6. Пакет обработки изображений СПАЙДЕР используется на протяжении большей части уточнения шагов. Ряд операций контролируется скриптами СПАЙДЕР, которые являются созданные пользователем пакетного управления файлами, содержащими последовательности операций и значений параметров. Окончательный реконструкции рассчитывается с использованием программы СПАЙДЕР люкс.

5. Представитель Результаты:

Одного ВИЧ-1 CA A92E трубки (рис. 1а) коробку, и ее преобразование Фурье (рис. 1б) была рассчитана для винтовых индексации. Для слоя линий (1, 0) и (0, 1), л ₁₀ = 28, L ₀₁ ​​= 37, R ₁₀ = 55, R ₀₁ = 44. Учитывая трубки радиусом 211.57Å, мы аппроксимировать N ₁₀ =- 12, N ₀₁ = 11 (здесь, беспристрастности было предопределено). С повторить расстоянии 5195.48Å, винт симметрии трубки была определена как Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz и Δφ были уточнены в 7.1321Å и 328,86 °, используя IHRSR (рис. 2а) и первоначальной реконструкции показана на рис. 2b. Окончательный реконструкции (рис. 3), после итерационным уточнением, улучшенная карта плотности значительно от исходной модели рассчитаны с IHRSR (рис. 2б).

Рисунок 1. Индексация ВИЧ-1 трубка CA винтовой. (А) одного ВИЧ-1 CA A92E ЭОП. Шкала бар, 30 нм. (Б) преобразование Фурье трубки показана на (А). Винтовой индексов (п ₁₀ =- 12, N ₀₁ = 11), обозначим. Стрелка указывает на слой линии 23A разрешения.

Рисунок 2. Первоначальной реконструкции использованием IHRSR. (A) Винт симметрии определение для каждого итерационного цикла. Δφ и Δz, начиная с начальных значений, сходящихся к устойчивых значений после 10 итерационным уточнением циклов. (B), первоначальный 3D карта плотности после 10 итерационные циклы.

Рисунок 3. 3D-карта плотности после итерационным уточнением. (AC) плотность карта CA труб отображается в виде трех ортогональных ломтиками: параллельно оси трубки и близко к поверхности (А), перпендикулярной к оси трубки (B), и параллельно и по оси трубки (С) . Шкала баров, 10 нм. (D) Поверхностный оказание 3D карта плотности контуром на 1.8s вмещающих 100% объеме.

Мы представляем набор протоколов, чтобы обеспечить простой подход для получения 3D-структуры спиральных объектов. Использование описанной процедуры, мы приобрели 3D структуре ВИЧ-1 капсида сборки из одного изображения трубки (176 сегментов). Высшие структуры разрешение может быть достигнуто за счет включения большего объема данных изображений.

Есть несколько критических точек для оптимального сбора и анализа данных: во-первых, во время подготовки крио-ЭМ образец, пример решения должны быть уничтожены, оставляя равномерный, тонкий слой раствора, который немного толще, чем размер выборки. Есть несколько различных способов пятно образца. Для бактериальных клеток и трубчатых образцов, таких как ВИЧ-1 CA сборка, промокательной от одной стороны, в частности, с задней стороны, является наиболее подходящим.

Во-вторых, беспристрастности спирали должна быть определена, так как это не может быть сделано путем индексации винтовой или реконструкции. Обычной практикой является использование стоп-травления, а затем поворотные слежку ¹⁸ для определения беспристрастности. Беспристрастность может быть определена после реконструкции, когда разрешение плотности карту достаточно высока; 3D атомных моделей отдельных компонентов должны хорошо вписываются плотности карте при правильной беспристрастность предполагается. В противном случае, противоположную направленность следует считать.

В-третьих, фильтр Винера следует применять во время обработки изображения, как для фазовой и амплитудной коррекции, для снижения уровня шума усиления. С CTF от одного изображения всегда имеет нулевое пересечение, часть информации в обратном пространстве теряется. Поэтому, необходимо иметь несколько наборов данных проекции включены для 3D реконструкции, каждый отображаемого при различных значениях расфокусировать.

Нет конфликта интересов объявлены.

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Gongpu Чжао и Danxia Ke для технической поддержки. Мы благодарим доктора. Эдвард Egelman и Нико Григорьев для обмена их обработки изображений программное обеспечение. Мы также признаем, сотрудники, которые поддерживают структурной биологии крио-ЭМ объекта и Беовульф кластера и сетки в Университете Питтсбурга школа медицины. Эта работа была поддержана GM082251 и GM085043.

1. Frank, J. & Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
2. Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
3. Egelman, E.H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
4. Egelman, E.H., Francis, N., & Derosier, D.J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
5. Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R.A., & Downing, K.H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
6. Jimenez, J.L. et al. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
7. Butler, P.J., & Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
8. Namba, K., Yamashita, I., & Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
9. Byeon, I.J.L. et al. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
10. Toyoshima, C. & Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
11. Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
12. Ludtke, S.J., Baldwin, P.R., & Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
13. Yonekura, K. & Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
14. van Heel, M. et al. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
15. Sachse, C. et al. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
16. Mindell, J.A. & Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
17. Frank, J. et al. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
18. Zhang, P.J. & Hinshaw, J.E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.