위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Salmon, H., Rivas-Caicedo, A., Asperti-Boursin, F., Lebugle, C., Bourdoncle, P., Donnadieu, E. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. (53), e3054, doi:10.3791/3054 (2011).

드문 표현 항원을 감지 주변 림프절을 포함하여 이차 림프​​ 기관에 나이브 T 세포는 지속적으로 트래픽이. 림프절에 T 세포의 마이 그 레이션 chemokines 포함한 세포 화학 두 요소를 포함 복잡한 과정이다. 최근 두 광자 현미경의 사용은 그대로 림프절의 T 세포를 추적하고 다른 세포들과 그들의 행동과 상호 작용을 몇 가지 양적 정보를 추출하는 것은 허용하고 있습니다. 생체내 시스템에 명백한 이점이 있지만,이 방법은 복잡하고 비싼 장비가 필요하며 조직에 제한적으로 액세스할 수 있습니다. murine 림프절 내에서 T 세포의 동작을 분석하기 위해, 우리는 슬라이스 분석 ^1, 원래 neurobiologists로 설정하고 murine thymus ² 최근 바뀜을 개발했습니다. 이 기법에서는 찬란 라벨이 T 세포는 심하게 준비 림프절 슬라이스 위에 도금입니다. 이 비디오 문서에서는 조직에 T 세포의 현지화 및 마이 그 레이션은 위드 필드와 공촛점 현미경으로 실시간으로 분석됩니다. 생체내에서 두 광자 현미경은 그들의 자연 환경에서 이미지를 T 세포에 대한 효과적인 접근 방식을 제공하며, T 세포의 마이 그 레이션을 기본 메커니즘을 명료하게하다 보완하는 기술.

1. 림프절에서 준비 조각

1. 삽입을위한 4% 낮은 용융 점 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. PBS 및 마이크 로파이 솔루션의 아가로 오스를 희석. 아가로 오스가 완전히 해소되면 ° C까지 사용을위한 준비 37 솔루션을 유지합니다.
2. 6 잘 조직 문화 플레이트를 준비합니다. 물론 당 1.1 ML RPMI 전체 문화 매체를 추가하고 각 우물에 organotypic 필터를 삽입합니다. 4 6 - 그럼 플레이트 플레이스 ° C 조각을 전송할 준비까지.
3. RPMI 완벽한 매체로 가득 플라스틱 그릇에 4 mm의 내부 직경과 함께 스테인리스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔는 더욱 vibratome 컷 슬라이스에있는 세포를 집중하는 데 사용됩니다.
4. 현지 동물 복지 규정에 따라 마우스를 희생. 조심스럽게 주위 조직에서 주변 림프절을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 플라스틱 접시에 놓으십시오. 이들 장기는 매우 부드럽고로 치료는 림프 노드 구조를 손상하지 않도록해야합니다.
5. 35 mm 플라스틱 그릇에 4 % 아가로 오스 겔 -를 붓고하고 정교한 젤로 노드를 전송합니다. 하든 5 분 얼음 아가로 오스 겔를 남겨주세요.
6. 접시에서 블록을 제거하고 각 림프절 주위 젤의 3~5mm를 떠나하기 위해 한천을 잘라.
7. 무독성 조직 접착제와 vibratome의 표본 디스크에 포함된 노드를 연결합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 가득한 사진첩의 표본 디스크를 설치합니다.
8. 섹션 한천 - 임베디드 중간 범위 (1.5 ㎜)에 설정된 속도 범위에 설정된 vibratome 속도 (0.3 mm / s)로하고 진동 주파수와 320 μm의 두께로 조직을.
9. 그들이 좋은 집게를 사용하여 organotypic 문화 삽입에 절단되는 등 신중하게 림프절의 조각 전송할 수 있습니다. 각 삽입 3 조각 플레이스. 조각이 쉽게 손상될 수있는 큰주의를 기울이시기 바랍니다. 320 μm의에서자를 때 전형적인 주변 림프절은 5 섹션을 얻을 것입니다. 그들은 단지 피상적인 조직을 포함하는 등, 처음이자 마지막 조각 폐기하십시오.
10. 각 슬라이스에 스테인레스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔가 잘 조직을 둘러싸고있는 아가로 오스에 위치하고 있는지 확인하십시오.
11. 37 문화 판을 품어 ° 5 % CO ₂ 배양기에서 C humidified 플레이트 T 세포 준비까지.

2. 마우스 림프절에서 T 세포를 분리

1. 이전에 게시된 조브의 제 ^3에 따라 T 세포를 분리.
2. 바로 T 세포를 사용하여 다음 섹션을 참조하십시오. 그렇지 않으면, lymphocytes 10 NG / ML IL - 7과 함께 보충 RPMI - 미디어 전체에 야간 교양 수 있습니다.

3. 절연 T 세포의 라벨링

1. HBSS에 세포를 씻으십시오. ML 당 10 × 10 ⁶ 동일한 버퍼에서 그들을 Resuspend.
2. 0.5 μm의의 최종 농도를주는 1 μm의 세포 커 녹색 CMFDA이 포함된 HBSS 같은 볼륨을 추가합니다.
3. ° C 5 분 동안 37 세포 현탁액을 품어. RPMI - 중간 완료와 함께 두 번 세포를 씻으십시오.
4. RPMI - 매체 전체에서 ML 당 10 × 10 ⁶ 최종 농도에서 세포 Resuspend. 이러한 레이블 세포 조각에 도금 것입니다.

CMFDA 이외 형광 염료도 사용하지만, 이러한 분자가 특정 농도 이상의 잠재적인 독성이있다 명심 수 있습니다.

4. 림프절의 조각에 도금 분류 T 세포

1. 피펫으로 세탁기의 내부 부분에 포함된 초과하는 매체를 제거합니다. 조직이 건조되는 것을 허용하지 않습니다,이 단계에서 신속하게 작동합니다.
2. 부드럽게 세탁기의 내부 부분을 1로 2 X 10 ⁵ 세포에 해당하는 10-20 μl 표시 T 세포를 분배. 케어는 피펫의 끝에있는 조직을 접촉하지 않도록해야합니다. 세포 현탁액의 드롭이 자리에 유지 있는지 확인하십시오.
3. 37 인큐베이터에있는 세포와 조각 플레이스 ° C와 5% lymphocytes는 조직으로 마이 그 레이션 수 있도록 최소 30 분 CO _2.

5. 림프절의 슬라이스 내에 이미징 T 세포

이 비디오 문서에서는, 우리는 위드 거꾸로 현미경과 공촛점 직립 현미경으로 림프절 슬라이스의 이미지 형광 T 세포.

1. 37 온도를 설정 ° C. 우리의 현미경은 온도 제어 챔버를 갖추고 있습니다.
2. 산소 (5 % CO ₂ 95 % O ₂₎ 페놀 레드 무료 RPMI 매체와 림프절 슬라이스의 지속적인 재관류를 지원 재관류 체제를 설치하십시오. Google 시스템에서, perfused 미디어는 중력에 의해 한쪽에서 이미징 챔버에 들어갑니다. 매체는 폐기물 수집 플라스크에 연결된 펌프 aspirated입니다. 미디어 유량 1 ML / 분으로 설정합니다.
3. 고급 집게로 정교한 6 잘 판에서 슬라이스를 가지고 조직에 침투하지 형광 세포를 제거하는 몇 초 동안 예열 산소 RPMI 매체의 준비를 찍어.

IMA넓은 필드가 바뀌 현미경으로 T 세포를 ging

4. 유리 바닥 요리의 내부 부분에 접착 나일론 스레드로 구성된 사용자 정의 만든 영상 챔버에 거꾸로 슬라이스를 놓습니다. 이 챔버에서 나일론 스레드는 유리에서 슬라이스를 제고하고 조직으로 확산하는 산소 솔루션을 가능하게합니다. 림프절의 T 세포의 마이 그 레이션 산소에 강하게 의존이므로이 필요합니다. 그 위에 스테인리스 스틸 와셔를 추가하여 슬라이스를 확보. 이러한 조건에서 슬라이스는 재관류 솔루션의 갱신을 용이하게 요리의 바닥 위에 몇 미크론을 자리잡고 있습니다.
5. 보기의 넓은 분야 (800 × 800 μm의, 노드의 슬라이스 표면의 약 3 분의 1을) 캡처하려면, 10X 건조 목적 렌즈를 사용하여 이미지를 수집합니다. 우리는 10X 니콘 S 플루어 0.5 NA 우리 분석에 가장 적합한 것으로 나타났습니다.

전형적인 시간 저속 영상 실험은 축 (Z) 차원에서 50 μm의 총 깊이를 스팬 5 광 비행기를 캡처합니다. 형광 T 세포는 일반적으로 10-20 분 동안 10-30초을 이르는 간격으로 몇 군데 있습니다.

공촛점 직립 현미경으로 이미징 T 세포

이 프로토콜에서 사용 공촛점 현미경 20x 물 침지 목표 (올림푸스, 20x/0.95 NA)이 장착된 Leica SP5입니다.

6. 현미경의 이미징 단계에 슬라이스를 고정합니다. 참고 : 우리는 보통 그것을 고정하기 위해 준비에 세탁기를 놓으십시오.
7. Z 축 따라 이미지의 시리즈를 수집하여 이미지 세션을 설정합니다. 손상 조직 구조의 이미지 T 세포하려면 시작 위치는 일반적으로 첫 번째 레이블이 붙은 T 세포 아래의 5-10 μm의에서 설정됩니다.

6. 대표 결과

이 비디오 프로토콜에 따라 당신은 노드의 T ​​존, 정상적으로 생체내 (그림 1)에서이 특정 환경에서 발생하는 현상에 축적 형광 T 세포의 큰 숫자를 시각화하는 기대한다. 특히, T 세포는 단지 캡슐 밑에 일반적으로 B 세포 영역에서 제외되어야합니다. 성공적인 실험은 그대로 림프절 ⁴ 얻은 결과를 출판과 일치 높은 운동성이있는 행동 (그림 3)를 표시하는 조직 (그림 2)에 들어갔다 T 세포가 발생합니다. 평균, 조각 내의 개별 T 세포의 평균 속도 가까운 10 μm의 / 분 (그림 4)되어야합니다.

그림 1. T 세포는 림프절의 슬라이스에 축적. 찬란 - 표시 T 세포는 (CMFDA, 녹색) 이미지 수집하기 전에 림프절 슬라이스 30 분 (위 사진)에 추가되었습니다. 이미지는 Z 방향으로 50 μm의를 스팬 5 이미지의 최대 투영이다. 명시야 이미지는 하단에 표시됩니다. 이미지는 위드의 현미경으로 캡처했다.

그림 2. T 세포는 림프절의 슬라이스에 들어갔다 있습니다. 찬란 - 표시 T 세포는 (CMFDA, 녹색) 공촛점 현미경을 사용하여 이미지 수집하기 전에 림프절 슬라이스 30 분 추가되었습니다. 이미지가 절단 표면 (상단 사진) 아래 40 μm의 (아래 사진)에서 캡처했습니다.

그림 3. T 세포는 림프절의 슬라이스 내에 높은 운동성이있는 수 있습니다. 찬란 - 분류 T 세포 위드 현미경을 사용하여 12 분 동안 몇 군데 있었다. 개별 T 세포의 궤도는 파란색 (낮은 운동성이있는 세포) 레드 (높은 운동성이있는 세포)로부터 증가 변위를 나타내는 색으로 트랙으로 표시됩니다. 트랙 Imaris 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 점선 타원은 putative B 세포 영역을 delimits 반면 '화이트 라인은 노드의 가장자리를 따릅니다.

그림 4. 림프절의 슬라이스 내에 T 세포 속도는 10 μm의 / 분 가까운 거리에 있습니다. 속도는 그림 3에 나타나 트랙에서 Imaris 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.

우리는 도입 T 세포의 동작을 조사하는 데 사용되는 림프절의 조각을 생성하는 간단한, 빠르고 강력한 기술을 설명합니다. 최근에는이 방법이 성공적으로 T 세포의 위치와 운동성 ^1.5을 제어하는 세포 요소를 식별 thymic 및 림프절의 조각을 사용하여 적용되었습니다. 또한 긍정적인 선택을하는 동안 및 항원 인식 ^2,6에 따라 T 세포 thymocytes에서 칼슘 ^{2 +} 반응을 측정하는 데 사용되었습니다. 오버레이 슬라이스 분석은 장점과 논의가 될 자격 제한을 선물한다. 한 요구가 셀 마이 그 레이션의 분자 제어 방해하기 위해 pharmacologically 조각을 조작하는 경우의,이 시스템은 유용 조직에 액세스할 수 있습니다. 이미징 이후에, 조각이 몇 군데있다 구조에 대한 자세한 정보를 수집 immunohistochemistry에 대해 처리할 수 있습니다. 또한, 관찰은 전통적인 위드의 형광 현미경으로 만들 수 있습니다. 해상도 공촛점 또는 두 광자 현미경으로만큼 좋지 않아 그 phototoxicity은 원칙적으로 두 개의 광자 현미경보다 한 광자 더욱 심각한 있지만, 그것은 단순의 이점, 낮은 비용, 더 큰 선택의 여지가 여기 파장의.

손상 림프절의 T 세포의 이미지가 표시 lymphocytes의 정맥 주사가 필요 림프 기관으로 연속적으로 가정되는. 우리가 이전에 ¹ 보여준 바와 같이, 슬라이스 분석은 입양 전달 실험과 완벽하게 호환됩니다. 그러나, 림프절에 집에 T 세포에 필요한 시간의 길이는 시간이지나면서 세포 밖으로 누설하는 경향을 형광 염료의 사용을 복잡하게하실 수 있습니다. 이것은 칼슘 ^{2 +} 염색 fura - 2의 경우입니다. 조직에 T 세포의 빠른 채용 (<30 분)으로 슬라이스 분석은 염료를 사용하는 기회를 제공합니다. 마지막으로,이 방법은 여러 사람이 조직에서 T 세포의 기능을 분석할 수있는 큰 장점 살려두고있다.

이 실험 시스템은 또한 염두에 보관해야합니다 한계를 제공합니다. 깔끔히과 관련된 손상이 특히 상처 표면 근처의 조직의 표면 영역에서 T 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이스 내에서 세포 죽음을 평가하기 위해, 우리는 타협 플라즈마 막과 세포를 관통하는 형광 염료 SYTOX 녹색을 사용했습니다. 우리의 실험은 주로 조직의 표면 지역화된 총 결절 세포의 약 20 %가 찬란이 핵 염색으로 표시라고 밝히지. 분석과 함께 또 다른 잠재적인 우려 chemokines 포함하여 중요한 가용성 요소를 유지하는 조각의 능력입니다. 우리는 T 세포가 슬라이스 내에 좋은 운동성를 표시 이후의 데이터는 이러한 문제에 의해 영향을 받았다고한다는 표시도없고,하지만, 우리는 상처 표면에서 마이크론의 여러 수십에 위치하고 건강한 지역 이미징 T 세포의 중요성을 강조하고 싶습니다. 이것이이 프로토콜에 같은 전통적인 현미경 (위드 필드 또는 공촛점)와 함께 할 수, 반면에, 그것은 림프절 슬라이스 준비가 두 광자 영상은 깊이에 공간적 해상도를 향상시키고 phototoxicity을 줄일 수와 결합 가능성이 높습니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

저자는 우리가 림프 노드 조각을 수행하는 것이 좋습니다 박사 알랭 Trautmann 감사하고 싶습니다. 이 작품은 리그 Nationale Contre 르 암, Fondation 부어 라 레쳐치 Médicale 엉 프랑스와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. Asperti-Boursin, F. et al., CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204 (5), 1167 (2007).
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3. Matheu, M. P., & Cahalan, M. D., Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. 9, 409 (2007).
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6. Gollmer, K. et al., CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114 (3), 580 (2009).

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