重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化

Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e3061, doi:10.3791/3061 (2011).

原子力显微镜（AFM）允许个别蛋白质，DNA分子，蛋白质 - 蛋白质复合物，和DNA -蛋白质复合物的可视化。在显微镜的悬臂是纳米级的探针，它遍历图像领域从纳米到微米，测量海拔在任何给定的的点在基片表面上的大分子。静电作用引起的蛋白质，脂类，和核酸，以松散的随机取向的衬底的重视，并允许成像。生成的数据类似地形图，其中大分子三维颗粒离散大小（ 图^1）1,2解决。轻敲模式原子力显微镜涉及的悬臂的反复振荡，允许相对较软的生物材料如DNA和蛋白质的成像。原子力显微镜等纳米显微技术显着的好处之一是其相对的适应性，在水溶液中的缓冲区，其中包括近生理缓冲条件，实时，无染色或涂层样品成像，可视化单个蛋白和大分子复合物。

这里介绍的方法，介绍了成像的DNA和immunoadsorbed转录因子（即糖皮质激素受体 ​​，GR）的缓冲溶液（ 图2） 。 Immunoadsorbed蛋白质和蛋白质复合物，可以分开immunoadsorbing抗体珠颗粒与抗体的抗原表位，然后成像（ 图2A）竞争。这使得前成像利益的生物分子的生化处理。一旦纯化，DNA和蛋白质，可以混合，可以成像，以及由此产生的相互作用的复杂。 DNA的云母结合需要二价阳离子如镍^{2，3 +}或Mg ^{2 +的} ，这可以被添加到样本缓冲区保持蛋白的活性。原子力显微镜已经使用了类似的方法，利用可视个人的酶，包括RNA聚合酶^和修复酶5，约束个人的DNA链。这些实验提供的蛋白质 - 蛋白质和DNA -蛋白质生物物理相互作用在分子水平上发生显着的洞察力。原子力显微镜成像个别大分子颗粒，可确定粒子的同质性，并有助于确定的成像颗粒组成部分的物理安排。虽然目前GR伴侣蛋白复合物^1,2和DNA链的GR可以结合可视化开发方法，它可广泛应用于成像DNA和蛋白质样品从多种来源。

1。准备的DNA和蛋白质进行成像污染物的样本

1. 分离生物分子成像和地方在一个合适的缓冲溶液。成像的蛋白可能纯化使用液相色谱^仪 6，免疫吸附其次^是 1,2抗体和沉淀，去除或Profinity确切的纯化和标记清除（ 图 2A ）。隔离的DNA分子成像小量纯化（ 图2B）。
2. 确认成像采用SDS - PAGE和免疫印迹的蛋白质样品的组成和纯度。对于DNA，确认序列，完成了限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳和纯洁性。
3. 孵育样品在原子力显微镜的吸附缓冲，促进坚持以云母样品。对于蛋白质样品，10毫米HEPES缓冲液可用于。以及可能会增加额外的低离子强度的盐或其他辅助因子。对于DNA样本，包括一个二价阳离子（如镁^{2 +}或Ni ^{2 +的} ），以促进吸附在云母基片。一个合适的Mg ^{2 +}含缓冲的DNA是10毫米的Tris，pH值7.5，10毫米氯化钠，2毫米氯化镁₂ ^3。另一种Ni ^{2 +的}缓冲是10毫米的HEPES，pH为6.8，10毫米NiCl _2。
4. 稀释样品的吸附缓冲5微克/毫升的浓度。轻轻地混合。而显微镜正准备冰商店。

2。安装原子力显微镜探针

1. 液体细胞探头支架放置到相应的悬臂安装扩展坞。
2. 找到长，厚的尖锐氮化杆（SNL）探针悬臂（简称为“B”悬臂）用于成像。小心地转移到液体细胞探头支架，确保针尖保持直立。技术说明：必须格外小心支付而探头在传输过程中从任何高度下降，可能会损坏或破坏悬臂或提示。一个microlever SNL（MSNL）探头可以用来作为替代的SNL探头。
3. 从扩展坞中取出探头支架和光显微镜下检查，以确保它是完整的和正确地固定在液体中的细胞探头支架悬臂。
4. 拧紧滚花头紧固螺钉，小心地从仪器衔接大会的原子力显微镜头。技术说明：必须格外小心，同时操纵原子力显微镜头，甚至在短距离（例如，如果不正确地坐在燕尾大会）下降，可能造成实质损害。
5. 反转的原子力显微镜头和液体的细胞探头支架牢牢地推到了四针，在原子力显微镜头的基础。小心地返回到仪器衔接大会的原子力显微镜头。松开滚花头紧固螺钉固定到仪器原子力显微镜头。

3。定位悬臂尖端，结合激光，并调整光电探测器

1. 使用原子力显微镜的仪器软件，找到板载光镜下的移动旋钮在悬臂的针尖。调整显微镜的照明，如果有必要提高识别提示。携带到悬臂尖端仪器软件上显示的十字线接近结束。
2. 光学控制器上的软件的向上和向下箭头的调整，使悬臂尖端成为关注的焦点。使用慢（S）或中等（M）的速度，同时调整光学。
3. 将悬臂尖端的激光利用激光调节旋钮。移动调节旋钮，直到红色激光点内的白色照明点。跟踪沿悬臂使用锯齿形图案的胳膊，直到激光定位悬臂尖端。正确对齐，会出现一个强烈的反射点的原子力显微镜头的前窗。
4. 中心的光电探测器，通过调整探测器上的原子力显微镜头旋钮。仪器软件的探测器显示的十字线，这将调整激光点。所观察到的信号的总和应约4-6。

4。定位原子力显微镜头和调整悬臂

1. 将新鲜剥离的云母片磁化样品支架上的原子力显微镜的持有人板上面附着一个金属原子力显微镜标本光盘。此设置将被用于成像在第1步准备的DNA或蛋白质样品前位置的原子力显微镜头。
   1. 技术说明：磁化的样品架和液体细胞探头支架紧固机制和探头持有人比其他样品厚。如果目前有云母样品持有人大会和原子力显微镜头的不足之间的间隙，移动的原子力显微镜头几次选择仪器软件的退出图标。
2. 旋转原子力显微镜的持有人定位是最初的成像板，使标本光盘。确保云母基板的原子力显微镜头下的中心。
3. 对移动的原子力显微镜头云母标本的焦点表面控制仪器的软件光盘的表面。选择在Z电机中（M）的速度，并继续对表面的原子力显微镜头，直到约2毫米以上云母。此时，转用慢（S），Z电机的转速，以避免突然之间的探头和表面（称为崩溃​​的提示）接触。
4. 继续移动探针接近云母基材表面，特色鲜明，直到在云母表面或尖反射重点。表面和尖端的反映，使用“的重点是：”焦平面仪器软件的图标之间切换。
5. 选择仪器软件的调整图标和调整的悬臂。推荐的SNL和MSNL悬臂探针的共振频率为20-60千赫。选择一个5％的峰值偏移。技术说明：充足的悬臂调整是必需的足够的样品成像。

5。成像云母样品表面

1. 参与到云母表面的探头。设置初始扫描大小为10微米，扫描速度为1 Hz。积分增益和比例增益，可以初步设定为0.2和0.4，分别为。根据需要调整，为了跟踪和追溯扫描大致重叠收益。降低的幅度设定值将增加探头和云母之间的相互作用，并确保参与。
2. 捕捉10微米领域的完整的扫描图像。减少扫描尺寸为5，1，和0.5微米，捕捉每一个领域的完整图像。根据需要调整增益和扫描速度。捕获云母表面的图像提供的DNA和含蛋白质的样品进行比较的一个基准。
3. 放开探头单上脱离仪器软件图标点击。

6。成像生物分子的利益

1. 轻轻地混合在第1步准备的DNA或蛋白质样品，并准备加载到成像的云母表面。混合45新鲜的吸附缓冲液（最终样品的浓度为0.5微克/毫升）5μL准备好的样品。
2. 小心地添加50μL的0.5微克/毫升含有生物分子溶液直接到云母表面。不移动探头或原子力显微镜头，并确保样品溶液（但不吸管尖）与探头接触。
3. 暂停5分钟，让样品中的生物分子坚持以云母表面。
4. 在5分钟后，一个额外的吸管50-100吸附缓冲液注入液相细胞探头支架结束，小心不要触摸探头，原子力显微镜头，或用吸管尖云母。这将形成一个半月板，并允许在流体中的AFM轻敲模式成像。图3显示了流体细胞，悬臂式，样品，样品架，和半月板的最后安排。
5. 调整光探测器，并在必要时重新调整激光的悬臂。技术说明：查看探针和激光准直是复杂的，由于加入样品缓冲探头支架引起的衍射图样。悬臂式手动重新调整，如果需要的话。
6. 再搞探头使用的仪器软件。调整垂直偏转，积分增益，并在必要时的比例增益。这将开始重新成像的过程中，云母节前夕加样和捕捉图像扫描。
7. 增加扫描尺寸（500 NM - 10微米），以确定感兴趣区域。变焦和0.5 Hz的频率降低扫描速度，以提高图像分辨率
8. 一旦成像完成后，脱离探针仪器上的软件选择退出图标几次。确保足够的间隙之间的原子力显微镜头和液体细胞或标本盘拆装前的标本光盘。
9. 用蒸馏水彻底冲洗液细胞的探头支架和标本光盘，以防止残留的吸附缓冲蒸发形成的盐晶体。用压缩空气干燥。

7。代表性的成果：

图4中的原子力显微镜图像的例子。云母基片（一）提供了一个分子平坦的表面上的DNA和蛋白质可以吸附。前生物分子样品的成像云母提供了一个消极的成像噪声的控制和评估。它还提供了一个悬臂适当的调整和随后的样品成像会取得成功的保证水平。双链质粒DNA（B，D），推定超，很容易确定其不对称的外观和以前不起眼的云母基板上沉积的统一。谨慎的粒径（C，E的）的蛋白复合物，也从云母基板唯一区别的。粒度的差异表明样本异质性，可有用的逼近蛋白复合物的化学计量学或生化活性。一般的对角线形状和亲一致的方向在C组中观察到的蛋白颗粒是一种成像神器，如蛋白质会预计在云母基板上以随机方式面向。所观察到的神器可能的原因是一个物理的提示异常或原子力显微镜成像在过于快速的扫描速率。虽然提示卷积（ 如图1B所示）防止绝对长度测量计算，在X和Y轴（Z轴）高度测量和相对的X和Y的测量，可还是估计的成像生物分子的生物物理特性作出了有益的。

图1：轻敲模式原子力显微镜（AFM）的原理介绍。一，在显微镜。在悬臂年底是一个尖锐的的提示，振荡向上和向下，因为它在云母基板的表面进行扫描，生物分子复合体吸附。由于扫描仪在X和Y方向移动，激光束反射到一个位置敏感的光电二极管探测器地图提示动作，因为它传递坐在上的生物分子复合物，垂直（Z）距离，从后面的悬臂云母。 B.在提示卷积造成的X和Y方向的图像失真。传统的氮化硅针尖的名义半径大于颗粒成像，针尖接触样品的边缘，因为它穿越表面。在影像出现在X和Y方向的大颗粒，但没有Z轴方向的提示卷积结果。提示使用一个较小的名义刀尖半径的，可以减少这种效应。

图2：immunoadsorbed蛋白质和DNA样品制备的插图。一，发行immunoadsorbed的GR•HSP70蛋白的单克隆抗体（mAb）蛋白A琼脂糖凝胶（PAS）的颗粒复杂。孵化与含有单克隆抗体的抗原表位肽的immunopellet，将有利于颗粒GR•HSP70蛋白复合物的释放，使复杂的收集上清，可视化的AFM。乙，DNA的制备，原子力显微镜成像，需要使用一个二价阳离子吸附缓冲。二价阳离子增加云母基板上的DNA的亲和力。

图3：最后的安排的原子力显微镜头，液体细胞探头支架，样品，标本持有人，和缓冲区半月板。一，护理必须采取沉积到云母基板时，样品和额外的缓冲区，以避免吸管尖和原子力显微镜头，液体通话，和云母基板之间的身体接触。 B，A的放大倍率从标本光盘缓冲区半月板跨度液体细胞探头支架。

图4：云母基板的原子力显微（一），2xGal4 - 2xGRE luciferease质粒DNA（B，D），和GR•HSP70蛋白复合物在缓冲溶液中（C，E的） 。云母，与DNA和蛋白质的可视化控制图像。遗传资源•HSP70蛋白复合物的制备与HSP70和抗体珠颗粒释放使用一个单克隆抗体竞争性抗体（如图2A所示），然后催芽遗传免疫吸附。 DNA的制备按常规质粒小量。面板A，B和C相当于放大倍率（比例尺= 200 nm）的一样，都是面板D和E（比例尺= 40纳米）。

AFM成像个别无涂层的生物分子在水溶液和近生理缓冲的实时解决方案的能力提供了一个独特的微观技术。这使得个别蛋白质和DNA分子，以及多蛋白复合物和蛋白质- DNA复合物的可视化。与原子力显微镜成像大分子颗粒，可用于评估样品的均匀性，以确定所观察到的粒子组成部分的物理安排的有用。这种方法观察单个大分子颗粒可以成为一个有用的辅助手段，传统的生化技术，如免疫检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳，尺寸排阻柱色谱，提供重要的总结性的数据^，代表¹⁰ 3 -10 11个人利益的生物分子复合物目前，一个样本。

对多蛋白复杂的化学计量学，生物分子相互作用，和辅酶要求的研究都可以用原子力显微镜研究。这里介绍的方法可以调整，以适应具体的生物物理问题的兴趣。例如，使用液体电池探头支架能够交换缓冲区，它可以测定蛋白质复合物的形成辅助因子的要求。近实时的，甚至可以形成和DNA -蛋白质装配分离，而成像。利益的特定序列（如一个推定响应元素或新的蛋白质结合序列）与虚拟结合蛋白的混合，产生的DNA可与，和成像，分子间的相互作用提供直接证据。

轻敲模式原子力显微镜成像是大大降低复杂，如果干的样品，而不是在水溶液中的样本，和线性DNA站封闭圈DNA质粒都^被这种方式3,9成像利用。这里介绍的方法是利用缓冲解决方案的样本，以提供更多的生理成像环境。其他值得一提的成像蛋白质的方法也应予以考虑，包括近场红外^显微镜 10 。免疫吸附原子力显微镜驸互补提供了一个机会，准备无数的蛋白质复合物，使用以及建立的生化技术，然后可视化immunoadsorbing抗体珠颗粒释放。例如，immunoadsorbed遗传资源已检测的关联蛋白的分子伴侣HSP70 ¹以及动力蛋白马达蛋白^2，使用这种方法，以估计复杂的大小和化学计量。粒度和生物物理特性（如刚性）已确定在原子力显微镜成像样品^11,12中观察到的生物分子的身份。它也可以确认生物大分子相互作用的生物分子（如配体或单克隆抗体），将绑定到其目标，并造成颗粒大小的增加，如果目标生物分子是目前除了的身份。

没有利益冲突的声明。

这项工作是由美国国立卫生格兰特GM086822研究院资助。作者想感谢博士。亚历克Pakhomov保罗华莱士（华盛顿纳米用户设施Univ.（NTUF））和安德烈斯莱德（布鲁克AXS）的专家技术援助。 DNA原子力显微镜成像是在大学进行。华盛顿NTUF，国家纳米技术基础设施网络的成员。好心的2xGal4 2xGRE luciferease质粒是由基思山本博士（Univ.加州，旧金山）实验室提供。

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