Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

1, 2, 3

1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin, 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin, 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.234.231.49, User IP: 54.234.231.49, User IP Hex: 921364273

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).

Abstract: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

תקינה בתאי T (Tregs) הם מתווכים קריטית של סובלנות החיסונית העצמית אנטיגנים. בנוסף, הם הרגולטורים חיוני של התגובה החיסונית בעקבות זיהום. למרות המאמצים כדי לזהות סמן משטח ייחודי על Tregs, התכונה הייחודית רק הוא יכולתם לדכא את שגשוג ותפקוד של תאים T מפעיל. בעוד שברור כי רק מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש בהערכת תפקוד Treg אדם, זה הופך להיות בעייתי כאשר להערכת תוצאות חתך מחקרים שבהם תאים בריאים ותאים שבודדו נבדקים עם מחלות אוטואימוניות (כמו סוכרת מסוג 1-T1D) צורך כדי להשוות. קיימת שונות רבה בין מעבדות במספר וסוג של תאים המגיב T, טבע וכוח של גירוי, Treg: יחסי המגיב לבין מספר וסוג אנטיגן הצגת תאים (APC) בשימוש האדם מבחני חוץ גופית דיכוי. השתנות זו הופכת את ההשוואה בין המחקרים מדידת תפקוד Treg קשה. השדה Treg צריך assay דיכוי סטנדרטית זה יעבוד גם עם שני אנשים בריאים ואנשים עם מחלות אוטואימוניות. פיתחנו ב assay דיכוי במבחנה שמראה מעט מאוד התוך assay משונות גירוי של תאים T מבודד במתנדבים בריאים לעומת נבדקים עם הבסיס הרס אוטואימונית של הלבלב β-תאים. המטרה העיקרית של היצירה הזאת היא לתאר ב assay דיכוי במבחנה אנושי המאפשר השוואה בין קבוצות נושא שונות. בנוסף, assay הזה יש פוטנציאל להתוות הפסד קטן nTreg לתפקד צופים הפסד נוסף בעתיד, ובכך נושאים בזיהוי מי יכול להפיק תועלת מטיפול מניעתי המערכת החיסונית 1. להלן, אנו מספקים תיאור מעמיק של השלבים הכרוכים בהליך זה. אנו מקווים לתרום סטנדרטיזציה של ב assay דיכוי חוץ גופית המשמשת למדידת תפקוד Treg. בנוסף, אנו מציעים זה assay ככלי לזהות מצב של חוסר איזון מוקדם החיסונית סמן פונקציונלי פוטנציאל T1D.

Protocol: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

1. לפני הקמת assay דיכוי, צריך חרוזים מעיל tosylactivated עם אנטי אנושי CD3 (שיבוט UCHT1, 1μg/ml הריכוז הסופי) לגירוי התא ולאחר מכן לבדוק אם חרוזים הם מצופים ביעילות על ידי הגדרת ב assay שגשוג במבחנה באמצעות אדם T לתאים

  1. קח 1ml של M-450 חרוזים tosylactivated מבקבוקון המקורי, מקום לעמוד מגנטי להחזיק עד שכל החרוזים יש דבק בצד של הצינור. הסר את חיץ תוך הצינור עדיין עומדים המגנטי. קחו את הצינור מתוך עמדה מגנטי להוסיף 1ml של buffer1, במקום את הצינורית לעמוד מגנטי שוב להסיר את buffer1 תוך צינור הוא עומד המגנטי; חרוזים resuspend ב 1ml של buffer1 ולהוסיף 40μl של CD3 אנטי אנושית, להתסיס בשעה 37 ° C במשך 15 דקות, להוסיף 0.1% w / v BSA ולהמשיך התססה במשך 16 השעות הבאות.
  2. לשטוף את החרוזים buffer2 פעמיים במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס ופעם buffer3 במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלסיוס תוך שימוש לעמוד מגנטי כפי שהוסבר לעיל, להסיר את החיץ ואת resuspend את החרוזים 1ml של buffer2; חרוזים הם 8 / ml 4x10 ריכוז סופי ומוכן לשימוש.
  3. Aliquot 50,000 ו 25,000 PBMC / היטב triplicates בצלחת 96-היטב ולהוסיף מספר משתנה של CD3 מצופה חרוזים (4x10 8 חרוזים / ml, CD3 1μg/ml, למשל 1, 2, 3, 4, 5 חרוזים / תא ) על מנת לקבוע את המספר האופטימלי של חרוזים לכל תא. לאחר 72 שעות בתרבית, להוסיף 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 השעות הבאות. תאים בצלחת קציר קציר Multiscreen (Millipore), להוסיף נוזל הנצנץ ולקרוא לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT). השתמש חרוזים / יחס התא כאשר הם מעל לאלף הופעות 5000 אך פחות מ 15,000 כדי למנוע גירוי יתר של Tregs, אשר עלול לאבד את הפונקציה מדכאים. בדרך כלל, יחס של 3 חרוזים / תא מעורר שני המגיב ותאי Treg בכל קבוצות הנושא נבדק עד כה 1-4.

2. PBMC במנותק מן הדם כולו מתורמים בריאים או leukopacks אדם או מעיל באפי (BC) שנלקח בדרך כלל ממקורות מתנדבים בריאים וזמינים ללא תשלום מרכזי עירוי דם מקומי (איור 1)

  1. לדלל את לפנה"ס (~ 50 מ"ל) 01:06 עם PBS (להוסיף 250 מ"ל). עכשיו יש הנפח הכולל 300 מ"ל. לאט לאט שכבת 25ml של BC מדולל על גבי 15 מ"ל Ficoll Paque-PLUS הוסיף 50 מ"ל צינורות פלקון, מבלי להפריע את השכבות. צנטריפוגה ב 800xg (1400rpm בצנטריפוגה Sorvall עם דלי הרוטור מתנדנד SH-3000) במשך 30 דקות ב 4 ° C, עם הבלמים כבוי.
  2. בזהירות לאסוף את שכבת PBMC (שלב ביניים) ולהעביר אותו ל 50 מ"ל צינורות טרי פלקון. לשטוף PBMC ידי מילוי צינורות עד 50 מ"ל עם DPBS. איסוף 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ב 4 ° C. חזור כביסה צעד פעמיים, בכל פעם שילוב 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. מערבבים את כל כדורי תא לתוך שפופרת 50 מ"ל אחד.
  3. הרוזן PBMC באמצעות Trypan מבחן כחול הדרה. ביצוע דילול 1:10 ב Trypan כחול על ידי הוספת 20μl של PBMC כדי 180μl של Trypan כתם כחול. מערבבים היטב ולקחת 20μl לספור hemacytometer מיד. ספירת המספרים של כל התאים מוכתמת בלא כתם כחול רק ממוקם שני רחובות כל ריבוע ובו 16 ריבועים קטנים יותר. קח את הממוצע של שני המספרים ולהתרבות על ידי 10. מחלקים את המספר הזה על ידי 100 כדי לקבל את מספר PBMC / ml. אחוז תאים לחשב כמו קיימא [1 - (מספר התאים כחול / מספר התאים הכולל) x100]. אם המשך הכדאיות היא ≥ 95%.

3. MACS מראש מסוג CD4 ותאי T

  1. לפני שנמשיך, העברת 1ml של PBMC לתוך צינור חדש, להוסיף 4ml התקשורת להכין תאים עם הקרנה 5000rad, אלה יהיו אנטיגן הצגת תאים (APC).
  2. צנטריפוגה שאר התאים בכל 250xg במאגר PBS/2mM BSA EDTA/0.5% עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את התאים supernatant ו resuspend ב 4ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
  3. הוסף 200μl של microbeads MACS אנטי CD4 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  4. שטפי ידי הוספת 40ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5% ו צנטריפוגות ב 250xg עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את supernatant ו resuspend ב 8ml של הטמפרטורה degassed, חדר חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
  5. מסנן להפריד את ההשעיה התא באמצעות טרום הפרדה מסננים אותם לפני העמסה על עמודה LS.
  6. פיצול ההשעיה התא 4ml שכבה כל עמודה LS מכויל על (עם 3ml של deggassed חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%). טור קבוע ב LS מפריד MidiMACS. לפני ההשעיה תא שנגמר, או להפעיל מחדש flowthrough או להוסיף 3ml של בטמפרטורת החדר deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% חיץ BSA ולתת למאגר לרוץ דרך. הוסף חוצץ יותר עד שזה מגיע ברורה החוצה.
  7. חיץ פיפטה 5 מ"ל deggassed על הטור LS, להסיר עמודה LS מ מפריד MidiMACS ומקום לתוך צינור איסוף סטרילית חדש 15 מ"ל לתת ~ לרוץ 1.0ml דרך. מכניסים את הבוכנה לתוך עמוד ולאט לאט לדחוף את שארנפח החוצה.
  8. לעשות את אותו הדבר עם שתי עמודות LS לשלב את שני שברים מסוג CD4 +. הוספת עד 50 מ"ל תאים PBS ולספור. התשואה הצפויה היא עד 5x10 8 תאים. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend היטב 2ml חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.

4. מיון פלורסנט Activated Cell (FACS) בידוד (איור 2)

  1. הפוך את קוקטייל של נוגדנים סמנים CD אל פני השטח סמנים הבאים לתא (לשמור מוגנים מפני אור): 20 μl של אנטי אנושי CD8-FITC (שיבוט RPA-T8), 20 μl של אנטי אנושי CD14-FITC (שיבוט M5E2; קולטן LPS), 20 μl של אנטי אנושי CD32-FITC (שיבוט FLI8.26; FcγR-type II) 6 μl של אנטי אנושי CD116-FITC (שיבוט M5D12: GM-CSFRα שרשרת) וכן, לחילופין, להוסיף אנטי 40μl אדם-CD4-APCCy7 (שיבוט RPA-T4).
  2. קח 5μl מתוך ההשעיה תא 2ml ואת הכתם עם 2μl של קוקטייל כתם, זה צינור לקביעת סף (Fluorochrome מינוס אחד FMO) 5.
  3. הוסף 50 μl של אנטי אנושי CD25-PE (שיבוט M-A251, IL-2Rα) לקוקטייל כתם, ולהוסיף את קוקטייל ההשעיה התא דגירה על 4 מעלות צלזיוס 30 דקות. שטפו תאים PBS חיץ, צנטריפוגות ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend לריכוז תאים של 10 7 / מ"ל.
  4. הכן בלא כתם תאים תאים או חרוזים מוכתם fluorochrome יחיד שישמש לשלוט פיצוי מיון התא על FACS אריה (BD Biosciences, סן חוזה, ניו ג'רזי).
  5. רוכשת את התאים בצינור FMO אשר יאפשר למשתמש להגדיר את סף למיון של CD25 תאים + T (איור 2 א). קביעת השער סביב FITC שלילי תאים להוציא FITC חיובי התאים המרכיבים מונוציטים, מקרופאגים וכל CD4 + אחרים שאינם-T לתאים (איור 2b).
  6. בחלקה נפרדת, לצייר השערים-CD25, CD25low ו CD25high T-Tregs התאים (למעלה 1% של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25) (איור 2 ג). תת Cell בדרך כלל להראות הטוהר גבוהה (איור 2, 2e ו 2f).
  7. צנטריפוגה צינורות אוסף עם תאים ב 400xg במשך 10 דקות ולשמור אותם על הקרח עד ציפוי.

5. הגדרת התרבות תאים בצלחת 96-היטב (ערכת המצורף טבלה 1) ב 200μl/well

  1. 50μl Aliquot של CD3 מצופה חרוזים (1 מיקרוגרם / מ"ל) מחושב להיות 3 חרוזים / תא המגיב היטב, resuspended בתקשורת להשלים עם 10% נקווה האדם א.ב. בסרום בתחתית U-96-גם הצלחות. (לדוגמה, כדי להפוך את התקשורת עם 2ml CD3 מצופה, לקחת 7.5μl ממלאי של CD3 חרוזים מצופים הגמר 4x10 ריכוז 8 / מ"ל ו לדלל ב 2ml של התקשורת; 50μl כל יכיל 75,000 beads-3beads/cell).
  2. מדולל APC מוקרן ריכוז 5x10 תא 5 / ml ולהוסיף 50μl (יכיל 2.5 x 10 4 תאים) לתוך הבאר עם כל גירוי נוסף בעבר, כולל בארות שכותרתו "Tregs בלבד", "APC רק" ו "התקשורת רק" בטבלה 1.
  3. הוסף 2.5 x 10 4 / טוב CD4CD25 או CD4CD25low בתאי T ב triplicates הבאים עיצוב בטבלה 1.
  4. הוסף Tregs לשתף תרבויות (שורה ב 'טבלה 1) ביחס 1:10 (2500 תאים Treg) ו לבארות שכותרתו "Tregs רק" ו דגירה את הצלחת ב 37 ° C ב-CO 2 באינקובטור עם 5% CO 2 , רווי בלחות למשך 72 שעות.
  5. דופק בארות עם 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 השעות הקרובות.

6. קציר ועוד היד נטויה

  1. קציר תאים על הצלחת הקציר multiscreen באמצעות Packard filtermate מקצרה או מערכת חלופית.
  2. הוסף נוזל הנצנץ (Microscint 20), מכסים קצירת צלחת עם מכסה פלסטיק שקוף כהכנה לשלב הסופי.
  3. קריאה לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT) או מערכת חלופית.

7. מחשוב אחוז דיכוי

  1. כאשר התאים בתרבית triplicates, הממוצע מחושב עבור כל תנאי. אם מקדם השונות הוא> 30%, outlier מסולקת ו לדקה רק שתי בארות הם ממוצעים. אחוז דיכוי מתקבל על ידי מחשוב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת.
  2. כפי נאיבי (CD25-) ו - in vivo מופעל (CD25low) ותאי T מפעיל הם מצופה כמו תאים המגיב T, ההבדל ביכולת של Tregs לדכא כל תת אלו שנתפסו בשימוש כמדד מנבא פוטנציאל תפקודי מבוסס על ההנחה כי תאי מופעל קשה יותר לדכא.

8. נציג תוצאות:

השונות הגדולה בשיטות המשמש והתוצאות הנגזרות ב assay דיכוי במבחנה האדם מתבקש לנו לבצע מחקר מקיף על התנאים המשפיעים על assay 1. פיתחנו assay כי בדיקות לא רק פונקציה Treg, אלא גם הטוהר שלהם, בהתחשב יחס נמוך בין Tregs: Teffs (01:10), אשר קבענו קודם 6. בנוסף, Tregs שונים הeir היכולת לדכא בהצלחה נאיבית in vivo המופעל בתאי T גם בנבדקים בריאים, כפי שמוצג באיור 3 ו במחקרים קודמים שלנו 2,4, אשר הופך בולט יותר, אם האיזון החיסונית נפגעת, כמו נושאים בסיכון לפתח T1D . Assay עבדו היטב במחקר שבו אנו מדכאים לעומת פונקציה של טבע (nTregs), ועין מתנהלת (iTregs) והן nTregs במבחנה מורחב, המאפשר לנו להשוות בין תפקידם לשלוט בריא, לאחרונה התפרצות (RO) T1D ו ארוכת שנים (LS ) נושאים T1D. הגענו למסקנה נושאים T1D RO לו יכולת טובה יותר לייצר תפקודית בשתי iTregs ו nTregs התרחב בהשוואה לנושאים LS לשלוט T1D ובריא 7. לפיכך, assay זה יכול לשמש ככלי מעולה הכרה של מדינה בשלבים מוקדמים ומאוחרים של חוסר איזון מערכת החיסון.

1 תוכנית סכמטי מצגת הצעדים מעורב ב assay דיכוי חוץ גופית

איור 1
באיור 1. צעדים של דיכוי ב assay במבחנה הציג עם תמונות

איור 2
איור 2. אסטרטגיה gating בבידוד תא FACS. סף) CD25 + הותאם על פי Fluorochrome מינוס אחת (FMO), ב) תאים היו סגורות כמו FITC שלילית, ג) FITC שלילי התאים היו מגודרת נוספים שנאספו CD + CD25-, CD + CD25low ו CD + CD25high ( Tregs) מוצג עם האחוזים, ד) FACS מיון Tregs לאחר מיון, ה) FACS מיון CD + CD25low לאחר מיון, ו) FACS CD4 + CD25 מיון-T לתאים לאחר מיון

איור 3
איור 3. תוצאות נציג של נבדקים בריאים) תוצאות נציג ספירות לדקה (CPM) של נבדקים בריאים כפי שהוצגו תרבויות יחיד עבור כל תת תא מעורב (נאיבי-CD25-, in vivo הופעל-CD25low, אנטיגן הצגת תאים ו-APC T רגולטוריים תאים-Treg), כמו גם שיתוף ותרביות של תאים המגיב T (CD25 או CD25low) ו Tregs. ב) אחוז דיכוי כל CD25 ו CD25low המגיב בתאי T על ידי Tregs עצמיים מוצג עבור קבוצת הבקרה בריאים (n = 4). דיכוי היה כפי שחושב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת. למרות הבדל קטן קיבולת של Tregs לדכא המגיב בתאי T היה שם לב, זה לא היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.08). ג) הוצג הן של עותקים לדקה בכל הנושאים סיכון תרבות כל אחת, כולל CD25 ו CD25low כמו המגיב בתאי T, וכן APC ו Tregs, ושיתוף תרבויות שבו כל תת T המגיב תא זרע עם אחוז (CD25-/Tregs ו CD25low/Tregs). ד) Tregs של דיכוי של כל CD25 ו CD25low תאים המגיב T על ידי עצמיים Tregs מוצג בכל הנושאים סיכון (n = 4). ההבדל ביכולת של Tregs לדכא CD25-מול CD25low המגיב בתאי T היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.04).

טבלה 1. סכמטי להגדיר ב assay של דיכוי חוץ גופית

1-3 4-6 7-9 10-12
CD4CD25- CD4CD25low התקשורת רק התקשורת רק
ב CD4CD25-/ Tregs CD4CD25low / Tregs Tregs בלבד APC בלבד
ג
D
E
F
G
H

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

כפי תכונה ייחודית רק Tregs, פונקציה מדכאים יש לבדוק באופן מהימן ואחיד בין הנושאים בשלבים שונים של התפתחות המחלה בתוך אותו בין מחקרים שונים. אנו מציעים פרטי assay דיכוי שפותחו במעבדה שלנו תרומתנו סטנדרטיזציה של assay זה. במחקר אופטימיזציה הנרחב שלנו, יש לנו קבעו כי גירוי תא T עם אנטי אנושי CD3 מצופה חרוזים (UCHT1 שיבוט, בריכוז של 1μg/ml (להבדיל 5μg/ml זמינים מסחרית) בשילוב עם PBMC כמו APC לספק גירוי טבעי מסוגל להפעיל גם הן תאים T ו המגיב Tregs בנושאים שנבדקו 1. הבחירה של נוגדן אנטי CD3 אדם היא בעלת חשיבות רבה, שכן בידינו רק נוגדן Ancell נתן את התוצאות הצפויות. גירוי סימולטני עם CD3 אנטי אנושי ואנטי CD28 אדם לא היה מספיק כדי לזהות הבדלים בין קבוצות נושא (תוצאות לא מוצגות), בעוד PBMC הציע לוח מלאה של שיתוף גירוי אותות, מגדילים את הסיכוי הולכת אותות וגירויים יעיל.

פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם leukopacks דם החולה. ההבדל היחיד הוא את כמות הדם שצריכה להיות טעון על גבי PLUS Ficoll-Paque בהליך בידוד PBMC. מדיה המשמשים assay זה מכיל 10% נקווה האדם א.ב. בסרום, שאנו נחושים להיות תוספת נהדרת assay. עם זאת, לפני בשימוש, סרום צריך להיבדק על היכולת להפעיל PBMC PBMC על עצמו (שלה זרע sixplicate ולהוסיף להשלים התקשורת RPMI עם סרום הישן, ללא בסרום עם סרום חדש. הדופק לאחר 72 שעות צלחת, דגירה 16 ​​שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, תאים הקציר ולקבל קריאות CPM). עותקים לדקה מוגברת של PBMC תרבותי עם הסרום החדש אינו תוצאה טובה ומציע צורך בסרום עם מספר הרבה חדש.

יש לנו קבעו כי MACS המיון נעשה באופן ידני עם עמודה LS חדשה מדגם זה נותן תשואה טובה יותר ניכר של תאים מסוג CD4 + T לעומת Automax. בנוסף, טוהר Treg היה נחוש בדעתו להיות> 95%, דהיינו על ידי ביטוי CD25 (איור 2), חוסר שגשוג במבחנה (איור 3 א), מדכאים פוטנציאל גבוה בנבדקים בריאים ב 1:10 יחס בין Treg: המגיבים ( איור 3ab) והביטוי Foxp3 הגבוה ביותר בקרב מבודדת תת T תא (מידע לא מוצג). התאים לזהם מסולקות כמו מזבלה FITC במהלך FACS הליך מיון בשלב הבא (איור 2b). FACS מכתים של הסמן CD4 אין צורך וזה האוכלוסייה התא ניתן לראות דרך FSC במזימה בשילוב עם אנטי אנושי CD25, אולם זה יכול להיעשות. Tregs ממוינות כמו 1% העליון של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25 בכל קבוצות נושא. החלת הליך קפדני על כל הנושאים של מעמד עצמאי למחלות אפשרה לנו להשתמש רק אחת היחס בין Tregs ואת המגיב ותאי T (01:10) בכל קבוצות הנושא נבדק. בנוסף, באותם תנאים לעבוד כל כך טוב את ההבדל Treg פוטנציאל מדכאים נתפסה בין נאיבי in vivo לתאי T מופעל לשמש המגיבים, אשר, בהתבסס על ההבדלים ביניהם, ניתן היה לצפות 1. קבענו גם כי לאחר FACS בתאים המיון צריך להיות סובב מטה בטרם הקים בשנת assay דיכוי.

הפצת נמדדה בעזרת thymidine tritiated. לחלופין, התפשטות תאים ניתן למדוד באמצעות 5-bromo-2'-deoxyuridine, אנלוגי פירימידין, אשר שולבו לתוך ה-DNA מסונתז החדש במקום thymidine. גילוי BrdU מבוסס על ניתוק של אירופיום, יון חייב נוגדנים להכיר BrdU (אנטי BrdU-EU), כי בהליך של גילוי אותות הקרינה יקבל שחרור ניתק כי ניתן למדוד fluorometer 8. על פי היצרן (DELFIA) assay זה רגישות דומה [3 ח] thymidine. מעקב אחר התפשטות תאים יכול להיעשות גם באמצעות, לדוגמה, נגזרות של מלח tetrazolium ב MTT או מבחני XTT זמינים ATCC, שם היחס בין מספר התא האות המיוצר יש הוקם לראשונה, המאפשר כימות spectrophotometric של השינויים בשער של התא התפשטות הכדאיות. עם זאת, חלופה אחרת היא שימוש כדאיות התא DHL ו assay שגשוג, מבוסס על כימות fluorimetric מספרים תא חי הכדאיות. בחירה אפשריים אחרים היא כתם המגיב בתאי T רק עם CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) ולעקוב אחר צמצום של הכתם עם חלוקה כל הבא בזמן culturing. עם זאת, בהתאם גירוי בשימוש assay, דגירה ארוכה של יותר מ -48 שעות יכול לגרום פסגות נבדל של תאים CFSE חיובי. לפיכך, כל מבחני יש כמה יתרונות וחסרונות וצריך להיות מותאם להשגת התוצאות הרצויות.

לאלף הופעות עבור בדיקות אנטי אנושי CD3 מצופה מבוצעים תמיד עלPBMC בריאים הם צריכים להיות מעל 5000 אבל לא מעל 15,000 מנת חרוזים לשמש לסוג זה של assay. אנחנו בדרך כלל להגדיר חרוזים שונים / יחס התא כאשר בודקים כל אצווה של חרוזים שאנחנו עושים, וברוב המקרים יש לנו עותקים לדקה העקבי ביותר עם 3 חרוזים / תא עם 25,000 תאים / היטב. אנחנו בדרך כלל לחזור על הציפוי אם לאלף הופעות במהלך בדיקות האצווה נמצאים מתחת 3000, עד שנגיע 5,000-15,000 לדקה / היטב. לכן, תהליך הציפוי נבדקה בכמה רמות ואנחנו רואים את זה אמין. לכן, כאשר המחיר לאלף הופעות של קבוצה מסוימת של נבדקים (כמו Auto-נוגדנים חיובי נושאים בסיכון לפתח T1D) באופן עקבי נמוך יותר לעומת אנשים בריאים, יש לנו סיבה להגיע למסקנה כי תהליך התמרה האות עשוי להיות בסכנה. , למרות מחקרים רבים השתמשו בתאים נאיבי כמגישי מבחני דיכוי שפורסם עד כה 9-12, כמה, למשל, השתמשו גם CD4 כמגישי בתנאים assay שונה מאוד 13 או PBMC כמגישי, בנוכחות PBMC כמו APC ו להגדיר אותם חד ושיתוף תרבות עם Tregs הוסיף 14 או 15 מונוציטים כמו מדכאי. למרות המחיר לאלף הופעות ייווצר כל הווריאציות assay ומסקנות על התפשטות ייעשה, אנו סבורים כי לאחר משנה אחיד טהורים תא כמגישי נותנת תוצאות ספציפיות יותר, בעל פוטנציאל להסיק מסקנות נוסף על שני Tregs ואת המגיבים. כפי assay דיכוי שלנו המובאים כאן כולל שני תת תא נפרד טהור כמגישי (CD4 + CD25 ו CD4 + CD25low), ניתן לקבל מידע רב ערך על הומאוסטזיס החיסון כאשר תוצאות בריאים מושווים או מושפעים נושאים בסיכון לפתח מחלה הנובעת ההפרעות של הומאוסטזיס החיסון (כמו T1D). כפי שמוצג על ידי מספר גדל והולך של מחקרים in vivo תאים מופעל T (CD4 + CD25low) מראות לקויה רגישות אפקט מדכא של Tregs 16-19. ההסבר המדויק על התנהגות הדורש חקירה נוספים. בנוסף לכך, אנו ואחרים הראו כי Tregs בנבדקים עם T1D לעשות יש פגם תפקודי 2,9,10, וזה נכון גם לגבי Auto-נוגדנים חיובי נושאים בסיכון לפתח T1D, כפי שהראינו איור 6 בדו"ח האחרון שלנו 1. אחת האפשרויות היא כי T מסוג CD4 כל התאים הנבדקים מושפעים בסיכון לפתח T1D להיות בעל מום שכיח הולכת אותות למנוע מהם להגיב על גירויים המשפיעים לתפקד כראוי ועל מפעיל שלהם. כתוצאה של הולכת אותות נפגעת, המגיב בתאי T יעורר לדקה נמוך יותר (שמוצג באיור 3c) ו Tregs לא לדכא ביעילות. האפשרויות זה או אחר להישאר כדי להיחקר נוספת. בשל לשחק תפקיד גדול Tregs בבריאות ומחלות, במעבדות רבות מדדו תפקוד Treg התאמת assay הצרכים והיכולות שלהם. לכן, גורמים רבים assay יכול להשתנות (המגיב / Treg, בידוד סוג ומספר של הטבע, המגיבים וכוח סוג גירוי, ומספר APC, היחס בין המגיב / Tregs, זמן תרבות, כמו גם שיטת מעקב אחר התפשטות ), המשפיעים על תפקוד Treg. עבודה זו, אם כן, יש מטרה כדי להתחיל בתהליך של סטנדרטיזציה של assay ומאפשר השוואה קלה וישירה של מחקרים שונים להערכת תפקוד Treg.

אם תתקבל, פרוטוקול זה יאפשר השוואה של פונקציה Treg בין מעבדות שונות בנושאים מושפע עם מחלות אוטואימוניות T1D אחרים. פרוטוקול זה כולל יישום רחב והוא יכול לשמש לצורך הערכה של תפקוד Treg של כל נושא, לא משנה של המחלה, אם כי ערך פרוגנוסטי שלה נוגע מחלות רק כי הם תוצאה של ההפרעות של הומאוסטזיס החיסונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

מחקר זה נתמך על ידי מקס McGee הלאומית למחקר המרכז לנוער Diabetesat לרפואה של וויסקונסין ומחקר ילדים של המכון ויסקונסין. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, או הכנה של כתב היד.

Materials: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PLUS Amersham 17-1440-03
DPBS-1X GIBCO, by Life Technologies 14190-144
Trypan Blue Invitrogen 15250-061
anti-CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-045-101
Pre-separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
EDTA Invitrogen 15575-020
BSA Sigma-Aldrich B4287
Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Biosciences 557852
Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2RÎ) BD Biosciences 555432
Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Biosciences 555366
Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) BD Biosciences 555397
Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) BD Biosciences 555448
Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRÎ chain) BD Biosciences 554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13
Anti-human CD3 Ancell 144-024
Buffer1 Home made 0.1M Na2B4O7 pH7.6
Buffer2 Home made PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
Buffer3 Home made 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
Complete RPMI media Home made RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate
[3H] thymidine PerkinElmer, Inc. NET027Z005MC
human pooled AB serum Atlanta Biologicals S40110
Multiscreen harvest plate EMD Millipore MAHFC1H60
Microscint 20 PerkinElmer, Inc. 6013621

References: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

  1. Jana, S. et al. The type of responder T-cell has a significant impact in a human in vitro suppression assay. PLoS One. 5, e15154 (2010).
  2. Glisic-Milosavljevic, S. et al. At risk and Recent-Onset Type 1 Diabetic Subjects Have Increased Apoptosis in the CD4+CD25+high T-cell fraction. PLoS ONE. 2, 1-7 (2007).
  3. Glisic-Milosavljevic, S. et al. Dynamic changes in CD4+ CD25+(high) T cell apoptosis after the diagnosis of type 1 diabetes. Clin Exp Immunol. 150, 75-82 (2007).
  4. Glisic, S. et al. Genetic association of HLA DQB1 with CD4+CD25+(high) T-cell apoptosis in type 1 diabetes. Genes Immun. 10, 334-40 (2009).
  5. Perfetto, S.P., Chattopadhyay, P.K., & Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-55 (2004).
  6. Jailwala, P. et al. Apoptosis of CD4+ CD25(high) T cells in type 1 diabetes may be partially mediated by IL-2 deprivation. PLoS ONE. 4, e6527 (2009).
  7. Glisic, S. et al. Inducible regulatory T cells (iTregs) from recent-onset type 1 diabetes subjects show increased in vitro suppression and higher ITCH levels compared with controls. Cell Tissue Res. 339, 585-95.
  8. Neville, M.E. et al. A comparison of biodistribution of liposomal and soluble IL-2 by a new method based on time-resolved fluorometry of europium. Cytokine. 12, 1702-11 (2000).
  9. Lindley, S. et al. Defective suppressor function in CD4(+)CD25(+) T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 54, 92-9 (2005).
  10. Brusko, T.M., Wasserfall, C.H., Clare-Salzler, M.J., Schatz, D.A., & Atkinson, M.A. Functional defects and the influence of age on the frequency of CD4+ CD25+ T-cells in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 1407-14 (2005).
  11. Cao, T. et al. Ex vivo expanded human CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells prevent lethal xenogenic graft versus host disease (GVHD). Cell Immunol. (2009).
  12. Viglietta, V., Baecher-Allan, C., Weiner, H.L., & Hafler, D.A. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Exp Med. 199, 971-9 (2004).
  13. Marwaha, A.K. et al. Cutting edge: Increased IL-17-secreting T cells in children with new-onset type 1 diabetes. J Immunol. 185, 3814-8 (2010).
  14. Earle, K.E. et al. in vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin Immunol. 115, 3-9 (2005).
  15. Mielcarek, M., Martin, P.J., & Torok-Storb, B. Suppression of alloantigen-induced T-cell proliferation by CD14+ cells derived from granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood mononuclear cells. Blood. 89, 1629-34 (1997).
  16. Lawson, J.M. et al. Increased resistance to CD4+CD25hi regulatory T cell-mediated suppression in patients with type 1 diabetes. Clin Exp Immunol. 154, 353-9 (2008).
  17. van Amelsfort, J.M., Jacobs, K.M., Bijlsma, J.W., Lafeber, F.P., & Taams, L.S. CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in rheumatoid arthritis: differences in the presence, phenotype, and function between peripheral blood and synovial fluid. Arthritis Rheum. 50, 2775-85 (2004).
  18. D'Alise, A.M. et al. The defect in T-cell regulation in NOD mice is an effect on the T-cell effectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19857-62 (2008).
  19. Venigalla, R.K. et al. Reduced CD4+,CD25- T cell sensitivity to the suppressive function of CD4+,CD25high,CD127 -/low regulatory T cells in patients with active systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 58, 2120-30 (2008).

Ask the Author: אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter