マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

Hall, L., Jude, K. P., Clark, S. L., Wengenack, N. L. Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format. J. Vis. Exp. (52), e3094, doi:10.3791/3094 (2011).

抗菌剤耐性の迅速な検出は、耐性結核菌（MTB）の増加を制御するための努力に重要です。マウンテンバイクの抗菌薬感受性試験（AST）は伝統的に比率の寒天法によるか、または/バクテック（Becton Dickinson社、スパークス、MD）、VersaTREK（TREK診断、クリーブランド、オハイオ州）またはバクテなどの機器上でmacrobroth試験によって行われているALERT（ビオメリュー、ヘーゼルウッド、ミズーリ）。と考えながら、寒天の割合の方法は、ASTの"ゴールド"スタンダードは、労働集約的であり、薬物のない寒天と比較して薬物含有寒天培地上にコロニー数を実行することで抵抗の計算が必要になります。薬剤を含まない培地と比較して薬物含有培地上≥1％の成長率がある場合は、生物は、その薬剤に耐性と考えられている。 macrobrothメソッドは、最初の行の薬（イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、およびピラジナミド）のインスツルメンテーションとテストのブレークポイント（"クリティカル"）の薬物濃度が必要です。ここで説明する方法では、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットで[MYCOTB（TREKの診断）]市販されており、最初の（イソニアジド、リファンピン、エタンブトール）およびセカンドライン治療薬（アミカシン、両方を含む結核の治療に使用される12抗菌剤の濃度を増加含まれていますサイクロセリン、エチオナミド、カナマイシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、パラアミノサリチル酸、リファブチン、およびストレプトマイシン）。ピラジナミド、最初の行の薬は、酸性試験条件の必要性に起因するマイクロタイタープレートに含まれていません。マイクロシステムの利点は、従来の寒天の割合（21日）と比較して前後の設定と高速ターン（14日）の使いやすさの両方が含まれています。さらに、プレートはブロスまたは固形培地のいずれを用いて調製した接種材料から設定することができます。マイクロタイタープレートフォーマットが新しくなるとマウンテンバイクが研究室で独自の安全性の課題を提示するので、このプロトコルは安全に設定する方法を説明するので、インキュベートし、マイクロタイタープレートをお読みください。

各研究室では、接種の準備のためとプレートに接種のピペッティングに適切なバイオセーフティレベルを決定するために、その制度生物学的安全管理者と共同でリスク評価を実行する必要があります。マイクロタイタープレートに接種し、プラスチックの接着シールで密閉されるまで、私たちの研究室では、我々は生物学的安全性レベル3実験室（BSL3）プラクティスを活用する。これらのプレートは、熱にも密封であるビニール袋、内側に配置されます。マイクロタイタープレートのインキュベーションと解釈読書はバイオセーフティーレベル2実験室（BSL2）で実施される。

1。材料のラベリング

1. ラベル血液寒天プレート、三ミドルブルック7H10プレート、ミドル7H9ブロス、生理食塩水、トゥイーンガラスビーズのチューブとBSL2の適切な識別子（例えば、患者名、医療記録番号）を持つマイクロタイターASTプレート。
2. ラベル血液寒天培地と"純度のチェック"などのメッキ7H10。接種の定期的なコロニー数は、生物の適切な濃度は、試験で使用されていることを確認することをお勧めします。実行コロニー数は"1 / 1コロニー数"と"50分の1コロニー数"で標識7H10プレートの二つを持っている必要があります。

2。 BSL3に入るテクノロジストの準備

1. 適切な個人保護具は、BSL3で作業する必要があるとソリッドフロントガウン、頭部カバー、手袋、靴カバー、および人工呼吸器が含まれています。各機関は、所属機関の産業衛生責任者と共同で独自の呼吸保護計画を確立する必要があります。当研究室では、我々はパワー空気浄化マスク（PAPRs）とフィットHEPAフィルタを通した、N95ハーフ顔の呼吸器を含む利用可能ないくつかの呼吸器を、持っている。

3。生物学的安全キャビネットの準備

1. BSL3では、表面を消毒し、空気の通気パネルから約6インチ消毒液で浸したペーパータオルを配置することによって、生物学的安全キャビネット（BSC）を準備する。
2. 廃棄物の左側の容器、および右側の小さいnephlometerとボルテックスを置きます。
3. 接種ループ、pipetorsとヒントは、ペーパータオルの横に配置されています。
4. 生物（ブロス中または固体培地上）とペーパータオルの上でマクファーランド0.5標準でラックを置きます。

4。比濁計のキャリブレーション

1. 比濁計で生理食塩水、トゥイーンのガラスビーズ管を配置し、生理食塩水、トゥイーンのブランクを使用してゼロに楽器を設定します。
2. 比濁計のマクファーランド0.5標準を置いて、製造元の指示に従って、キャリブレーション。

5。接種の準備

1. ≥0.5マクファーランド標準が得られるまで、適切に標識された生理食塩水、トゥイーンガラスビーズのチューブに滅菌ループを使用して固形培地からBSC、スクレープのコロニーでの作業。
2. 視覚的にサンプルを検査し、マクファーランド標準と比較する。
3. 30〜60秒間ボルテックスのサンプル。
4. 接種材料は、（タイマーを設定）15分のために解決することができます。

6。マイクロタイタープレートの接種

1. ステップ4.1と4.2でマクファーランド0.5に校正された比濁計を用いて生理食塩水、トゥイーンブロスで接種を調整します。これは、30分（メーカー仕様につき）以内に完了する必要があります。
2. 200μLピペッターと生理食塩水ビーズ、トゥイーンのチューブのTOP 3分の1 ^回の接種を100μLを削除するには、LONGエアゾール耐性をピペットチップを使用してください。ミドル7H9ブロスに接種する。 20秒間ゆっくりと渦を接種7H9ブロス。
3. メーカーのパッケージからASTマイクロタイタープレートを取り外します。箔のパッケージが破損している場合は乾燥剤が青色の場合、または使用しないでください。
4. 滅菌チューブに滅菌水50μLをピペットで50倍希釈の準備のために後で使用するために1:50希釈チューブを準備します。
5. 慎重に溝に7H9ブロス接種を注ぐ。エアロゾル発生を避ける。
6. あなたのラベル面を上にしてASTマイクロタイタープレートを置きます。
7. 各ウェルに接種を100μLを追加するには、12チャンネルピペッターを使用してください。
8. コロニーカウントのための希釈液を調製する：
   1. 1月1日希釈は、"1 / 1"とラベル7H10プレート上に1μlのループをストリーキングでも陽性対照（H12）から調製される。
   2. 50分の1希釈がよくポジティブコントロール（H12）から1μlのループを接種し、上記で調製した水管の50μlをチューブにそれを旋回することによって調製される。 "1 / 50"というラベルの付いたプレートにこの希釈のストリーク1μL。
9. 適切に標識された血液寒天培地と分離用7H10プレートとストリークの上に50μLをピペッティングすることによりトラフから純度のプレートに接種する。
10. の場所ASTのマイクロタイタープレート上に接着剤シール。シールの白いバックを使用して十分なシール性を確保するために各ウェルにしっかりと押します。折り目を避けてください。
11. ヒートシールやテープとビニール袋と密接に結核菌消毒剤と場所のマイクロタイタープレートに浸したペーパータオルでそれを拭いてマイクロタイタープレートを消毒する。
    1. ビニール袋がある主な板の漏れや流出でなければならないすべての培養液が含まれていることを確認するために二次的コンテナとして機能します。

7。材料と生物学的安全キャビネットの消毒

1. エアロゾルを製作するのを避けるために、廃棄容器に静かにそれを配置する前に接種したトラフの上に別のトラフを配置。
2. 結核菌消毒剤でダウン拭いてnephlometer、ボルテックス、プレート、チューブ、等を含むすべての材料を消毒し、BSCから取り外す前に、製造元の指示に従って消毒を保証するために適切な時間を待つ。例えば、Prospray、我々が使用する結核菌消毒剤は、抗酸菌を殺すために15分かかります。
3. オートクレーブの前に医療用ごみ袋とシールの廃棄容器を置きます。

8。インキュベーション

1. プレートを下にメディアとの注意を払って培養する必要のあるすべての液体をこぼしたり、飛散しないように注意してください。
2. BSL2実験室で5〜10％CO ₂で5〜10％のCO ₂で35〜37℃のインキュベーターでASTのマイクロタイタープレートのプレート、7H10と血液寒天プレートをインキュベートする。
   1. プレートはしっかりと密封されて、内側密封ビニール袋なので、私たちの研究室では、これは許容範囲です。
3. 3回以上のマイクロタイターASTプレートは、製造元の指示に従ってインキュベーターを重ねる必要があります。

9。代表的な結果

封印されたASTマイクロタイタープレートは、手動で補助としてまたはVizion（TREK診断）などの自動プレートリーダーでミラーを使用して読み取ることができます。プレートは、できるだけ早く接種後7日間として調べることができます。彼らは正かどうかを判断するための位置H11とH12での成長制御の井戸を調べて（すなわち、ウェルの底にある細胞の預金を持っている）。成長のコントロールウェルが正でない場合は成長のコントロールウェルが陽性になるまで（例えば、10日目、14日目）定期的に、プレートをreinc​​ubateと再検討する。

1. ミラーの読み取り：
   1. 場所は、プラットフォームにASTマイクロタイタープレートを密封。
   2. インキュベーションの7日後に成長のコントロールウェルを読んで、これは負、reinc​​ubate ASTマイクロタイタープレートの場合はtrue。
   3. 成長のコントロールが許容できる場合には、薬物を含むウェルをお読みください。各薬剤のために、成長の制御と薬剤の井戸を比較しても成長を持たない最初の希釈を記録。
   4. 成長は、濁度として、あるいはウェルの底にある細胞の預金として表示されます。
2. 楽器はリード：メーカーの指示に従って、以下の手順では、読書がVizionのプラットフォームで行われる方法の例は次のとおりです。
   1. ログインします。
   2. "MYCOTB"ASTプレートのソフトウェアを使用してください。
   3. ユーザーが直面しているバーコードで密封されたプレートを置きます。成長は、濁度として、あるいはウェルの底にある細胞の預金として表示されます。
   4. 成長のコントロールを読んで、これは負、reinc​​ubate ASTマイクロタイタープレートの場合は、プラスの成長を示していない各薬剤の最初のウェルに画面をタッチするプレートを読んでいれば。

純度のプレートをお読みください。血液寒天プレートは48時間後には成長を示してはならないと7H10純度のプレートは、ある生物の種類のコンフルエントな成長が必要です。汚染された場合、ASTマイクロタイターテストは、純粋培養から繰り返す必要があります。

よく下の表を使用して、陽性コントロールのコロニー数を計算します。

コロニーカウントキー

結核tuberculoの一部の菌株でパラアミノサリチル酸とが続くことがありますSIS。これは、ペレットを持っているすべての井戸を見て、エンドポイントとして、次の希釈と同じサイズのペレットを持つ最初のウェルを使用して解釈することができます。抵抗は、この薬ではまれである。

図1。 MYCOTBプレートを使用した代表的な結果。

プラス成長のコントロールを持つASTのマイクロタイタープレートの例を図1に示されており、各薬剤のエンドポイントのMIC（μg/ ​​mlの）が円で囲まれている。当研究室で行われた研究では、ASTマイクロタイタープレート法は、 結核菌の感受性試験のためのゴールドスタンダード寒天比例の方式と同等であることが示された。 ASTマイクロタイタープレートと寒天の割合の方法14時と21日間の最終的な解釈と伝統的な寒天の割合の方式と比較した場合、結果の迅速な報告がマイクロタイターASTマイクロタイタープレートで得られた、respectively.The ASTマイクロタイタープレートは、最初のテストの利点を有しており、耐性菌との過度の遅延を防ぐことができます同時にセカンドラインの薬剤。 ASTマイクロタイタープレートには、APMよりもセットアップや読みする方がはるかに簡単ですし、そのようなVIZION、手動ミラーと半自動化システムの両方は、プレートを読み取るために使用することができます。結核の薬剤耐性検査のMIC値の可用性は、特に"ボーダーライン"感受性とのそれらの分離株については、従来の臨界濃度の値に対する相対医師に有益な新しい情報を提供することがあります。

開示することは何もありません。

私たちは、試験期間中に彼らの助けのためにメイヨークリニックMycobacteriology研究室の検査技師に感謝いたします。

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