पहली और दूसरी लाइन ड्रग्स के लिए माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग परिसर के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता एक microtiter प्लेट स्वरूप में शोरबा कमजोर पड़ने द्वारा परीक्षण

Hall, L., Jude, K. P., Clark, S. L., Wengenack, N. L. Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format. J. Vis. Exp. (52), e3094, doi:10.3791/3094 (2011).

रोगाणुरोधी प्रतिरोध का तेजी से पता लगाने के प्रयास में प्रतिरोधी माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) में वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एमटीबी की रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (AST) के परंपरागत अनुपात से अगर विधि द्वारा या (Becton Dickinson, स्पार्क्स, एमडी) BACTEC, VersaTREK (TREK निदान, क्लीवलैंड, ओह) या BacT / जैसे एक उपकरण पर macrobroth परीक्षण के द्वारा प्रदर्शन किया गया है चेतावनी (bioMérieux, Hazelwood, MO). अगर अनुपात विधि, जबकि माना AST "सोने" मानक, श्रम गहन है और दवा युक्त अगर पर कॉलोनी मायने रखता प्रदर्शन के रूप में दवा मुक्त अगर तुलना द्वारा प्रतिरोध की गणना की आवश्यकता है. यदि वहाँ ≥ दवा युक्त मध्यम पर 1% की वृद्धि के रूप में दवा मुफ्त मध्यम की तुलना में है, जीव माना जाता है कि दवा के लिए प्रतिरोधी. macrobroth तरीकों इंस्ट्रूमेंटेशन और परीक्षण विराम ("महत्वपूर्ण") पहली पंक्ति की दवाओं के लिए बिंदु दवा सांद्रता (isoniazid, ethambutol, rifampin और pyrazinamide) की आवश्यकता है. विधि यहाँ वर्णित एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट स्वरूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है [MYCOTB (ट्रेक निदान)] और दोनों (isoniazid, rifampin, ethambutol) पहली और दूसरी लाइन ड्रग्स (ऐसे Amikacin सहित बढ़ाने से 12 तपेदिक के इलाज के लिए इस्तेमाल किया antimicrobials की सांद्रता शामिल हैं, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ऑफ़्लॉक्सासिन, पैरा aminosalicylic एसिड, rifabutin, और स्ट्रेप्टोमाइसिन). Pyrazinamide, एक पहली लाइन दवा, अम्लीय परीक्षण की स्थिति के लिए अपनी जरूरत के कारण microtiter प्लेट में शामिल नहीं है. Microtiter प्रणाली के लाभ दोनों आराम की स्थापना की और तेजी से समय के आसपास बारी पारंपरिक अगर अनुपात (21 दिन) के साथ तुलना में (14 दिन) शामिल हैं. इसके अलावा, थाली या तो शोरबा या ठोस माध्यम का उपयोग कर तैयार inoculum से स्थापित कर सकते हैं. चूंकि microtiter प्लेट स्वरूप नया है और बाद से एमटीबी प्रयोगशाला में अद्वितीय सुरक्षा चुनौतियां प्रस्तुत, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे सुरक्षित सेटअप करने के लिए सेते हैं, और microtiter प्लेट पढ़ें.

प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए उनके संस्थागत जैव सुरक्षा अधिकारी के साथ सहयोग में एक जोखिम मूल्यांकन प्रदर्शन inoculum की तैयारी के लिए और थाली में inoculum की pipetting के लिए उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर निर्धारित करने की जरूरत है. हमारी प्रयोगशाला में, हम 3 प्रयोगशाला प्रथाओं (BSL3) जैव सुरक्षा स्तर का उपयोग जब तक microtiter प्लेटें inoculated हैं, और एक प्लास्टिक के चिपकने वाली मुहर के साथ बंद. ये प्लेटें तो एक प्लास्टिक की थैली, जो गर्मी भी है सील के अंदर रखा जाता है. Microtiter प्लेट की ऊष्मायन और व्याख्या पढ़ने जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला (BSL2) में आयोजित किया जाता है.

1. सामग्री की लेबलिंग

1. लेबल एक रक्त अगर प्लेट, तीन Middlebrook 7H10 प्लेटें, Middlebrook 7H9 शोरबा, एक नमकीन के बीच कांच मनका ट्यूब और BSL2 में उपयुक्त पहचानकर्ता (उदाहरण के लिए, रोगी का नाम, मेडिकल रिकॉर्ड संख्या) के साथ एक microtiter AST थाली.
2. लेबल रक्त अगर और "पवित्रता चेक" के रूप में चढ़ाया 7H10. Inoculum की आवधिक कॉलोनी मायने रखता है सुनिश्चित करें कि जीवों की एक उपयुक्त एकाग्रता परीक्षण में प्रयोग किया जाता है के लिए सिफारिश कर रहे हैं. कालोनी जब प्रदर्शन मायने रखता है 7H10 "1 / 1 कॉलोनी गिनती" और "1 / 50 कॉलोनी गिनती" के साथ लेबल प्लेटों के दो है की आवश्यकता होगी.

2. टेक्नोलॉजिस्ट के लिए BSL3 में जाने की तैयारी

1. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों BSL3 में काम करने के लिए आवश्यक है और ठोस सामने गाउन, सिर को कवर, दस्ताने, जूते शामिल हैं, और एक श्वासयंत्र शामिल हैं. प्रत्येक संस्था में सहयोग उनकी संस्था औद्योगिक स्वच्छता अधिकारी के साथ अपने स्वयं के श्वसन संरक्षण योजना स्थापित करना चाहिए. हमारी प्रयोगशाला में, हम कई संचालित हवा शुद्ध (PAPRs) respirators और फिट HEPA फ़िल्टर, N95 के आधे चेहरे respirators सहित उपलब्ध respirators, है.

3. जैविक सुरक्षा कैबिनेट की तैयारी

1. BSL3 में, सतह disinfecting और निस्संक्रामक हवा वेंट पैनल से लगभग 6 इंच के साथ एक कागज लथपथ तौलिया रखने के द्वारा जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) तैयार करते हैं.
2. बाईं तरफ बर्बादी कंटेनर, और छोटे और सही पर nephlometer vortexer रखें.
3. Inoculating छोरों, pipetors युक्तियाँ और कागज तौलिया के बगल में रखा जाता है.
4. जीव (शोरबा या ठोस मध्यम पर) और कागज तौलिया पर मैकफ़ारलैंड 0.5 मानक के साथ एक रैक पर रखें.

4. Nephelometer के अंशांकन

1. Nephelometer में एक खारा के बीच कांच मनका ट्यूब प्लेस और खारा के बीच रिक्त का उपयोग शून्य साधन सेट.
2. Nephelometer में मैकफ़ारलैंड 0.5 मानक प्लेस और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जांचना.

5. Inoculum की तैयारी

1. BSC, ठोस माध्यम से परिमार्जन कालोनियों खारा उचित लेबल के बीच कांच मनका ट्यूब में एक बाँझ पाश का उपयोग कर जब तक एक ≥ 0.5 मैकफ़ारलैंड मानक प्राप्त की है में काम कर रहे हैं.
2. दिखने में नमूना निरीक्षण, और मैकफ़ारलैंड मानक के लिए की तुलना.
3. भंवर 30-60 सेकंड के लिए नमूना.
4. 15 मिनट के लिए (एक टाइमर सेट) inoculum बसने की अनुमति दें.

6. Microtiter प्लेट का टीका

1. खारा के बीच 4.1 और 4.2 चरणों में 0.5 मैकफ़ारलैंड लिए calibrated nephelometer का उपयोग शोरबा के साथ inoculum समायोजित करें. इस में 30 मिनट (प्रति निर्माता विनिर्देशों) के भीतर पूरा किया जाना चाहिए है.
2. एक 200 μL pipetter और एक लंबी एयरोसोल प्रतिरोधी pipet टिप खारा मनका के बीच ट्यूब के शीर्ष 1 / ³ से inoculum के 100 μL हटाने का उपयोग करें. Middlebrook 7H9 शोरबा टीका लगाना. धीरे धीरे 20 सेकंड के लिए inoculated 7H9 शोरबा भंवर.
3. निर्माता पैकेज से AST microtiter प्लेट निकालें. उपयोग अगर desiccant नीला है या यदि पन्नी पैकेज क्षतिग्रस्त है.
4. उपयोग के लिए एक 1:50 कमजोर पड़ने ट्यूब बाद एक बाँझ ट्यूब में बाँझ पानी की 50 μL pipetting द्वारा 1:50 कमजोर पड़ने की तैयारी में तैयार.
5. ध्यान से एक गर्त में 7H9 शोरबा inoculum डालना. एयरोसौल्ज़ पैदा करने से बचें.
6. आप का सामना करना पड़ लेबल के साथ AST microtiter प्लेट रखें.
7. प्रत्येक अच्छी तरह inoculum के 100 μL जोड़ने के एक pipetter 12 चैनल का उपयोग.
8. कॉलोनी मायने रखता है के लिए dilutions तैयार:
   1. 1 1 / कमजोर पड़ने सकारात्मक अच्छी तरह से नियंत्रण (H12) से 1 / 1 1 "लेबल 7H10 थाली पर μl पाश streaking द्वारा तैयार की है.
   2. 1 / 50 कमजोर पड़ने सकारात्मक अच्छी तरह से नियंत्रण (H12) से 1 μl पाश inoculating और ट्यूब में पानी के ऊपर तैयार ट्यूब के 50 μl के साथ घूमता द्वारा तैयार किया जाता है. स्ट्रीक 1 इस कमजोर पड़ने की थाली μL "1 / 50" लेबल.
9. एक उचित लेबल रक्त अगर और 7H10 थाली और अलगाव के लिए लकीर पर 50 μL pipetting द्वारा गर्त से शुद्धता प्लेटों का टीका लगाना.
10. जगहAST microtiter प्लेट पर एक चिपकने वाली मुहर. प्रत्येक अच्छी तरह पर मजबूती प्रेस सील की सफेद पीठ का उपयोग करके पर्याप्त सील आश्वासन. Creases से बचें.
11. यह एक कागज तौलिया के साथ एक tuberculocidal निस्संक्रामक और गर्मी सील या टेप के साथ जगह microtiter प्लेट एक प्लास्टिक की थैली और पास में से लथपथ पोंछते द्वारा microtiter प्लेट कीटाणुरहित.
    1. प्लास्टिक बैग एक माध्यमिक कंटेनर के रूप में कार्य करता है करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी शोरबा निहित है वहाँ प्राथमिक थाली के रिसाव या फैल जाना चाहिए.

7. सामग्री और जैविक सुरक्षा कैबिनेट की कीटाणुशोधन

1. एयरोसौल्ज़ का उत्पादन से बचने के लिए, यह त्यागें कंटेनर में धीरे रखने से पहले inoculated गर्त के शीर्ष पर एक और गर्त जगह है.
2. कीटाणुरहित एक tuberculocidal निस्संक्रामक के साथ नीचे पोंछते द्वारा nephlometer, vortexer, प्लेटें, ट्यूब, आदि सहित सभी सामग्री और निर्माता के निर्देशों के अनुसार BSC से हटाने से पहले कीटाणुशोधन बीमा के लिए उपयुक्त समय का इंतजार है. उदाहरण के लिए, Prospray, tuberculocidal निस्संक्रामक का उपयोग हम, माइक्रोबैक्टीरिया को मारने के लिए 15 मिनट की आवश्यकता है.
3. Autoclaving पहले एक biohazard बैग और मुहर में त्यागें कंटेनर रखें.

8. अण्डा सेना

1. प्लेट्स मीडिया के साथ incubated होना चाहिए नीचे और देखभाल करने के लिए spilling या कोई भी तरल splashing से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.
2. BSL2 प्रयोगशाला में 5-10% सीओ ₂ के साथ _5-10% सीओ 2 के साथ एक 35-37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में AST microtiter थाली थाली, 7H10 और रक्त अगर प्लेटें सेते हैं.
   1. हमारी प्रयोगशाला में, यह स्वीकार्य है क्योंकि प्लेट अच्छी तरह से सील और अंदर एक मोहरबंद प्लास्टिक की थैली है.
3. से अधिक नहीं 2 microtiter AST प्लेटें निर्माता के निर्देशों के अनुसार इनक्यूबेटर में खड़ी होना चाहिए.

9. प्रतिनिधि परिणाम

मुहरबंद AST microtiter प्लेटें मैन्युअल रूप से या एक स्वचालित थाली Vizion (ट्रेक निदान) के रूप में पाठक के साथ एक सहायता के रूप में एक दर्पण का उपयोग कर पढ़ा जा सकता है है. प्लेटों के रूप में टीका के बाद 7 दिन के रूप में जल्द ही जांच की जा सकती है. H11 और H12 पदों में वृद्धि पर नियंत्रण के कुओं की जांच करने के लिए निर्धारित अगर वे सकारात्मक रहे हैं (ie., अच्छी तरह से नीचे कोशिकाओं के एक जमा है). यदि वृद्धि पर नियंत्रण कुओं सकारात्मक नहीं हैं, थाली reincubate और समय - समय पर फिर से जांच (eg., 10 दिन, 14 दिन) तक वृद्धि पर नियंत्रण कुओं सकारात्मक रहे हैं.

1. मिरर को पढें:
   1. जगह मंच पर AST microtiter प्लेट सील;
   2. ऊष्मायन के 7 दिनों के के बाद वृद्धि पर नियंत्रण कुओं पढ़ें, अगर यह नकारात्मक, reincubate AST microtiter प्लेट है;
   3. यदि विकास को नियंत्रित करता स्वीकार्य कर रहे हैं, तो दवा युक्त कुओं को पढें. प्रत्येक दवा के लिए के लिए, पहली कमजोर पड़ने रिकॉर्ड है कि वृद्धि पर नियंत्रण के साथ दवा कुओं की तुलना द्वारा कोई विकास नहीं है.
   4. ग्रोथ turbidity के रूप में या एक अच्छी तरह से नीचे कोशिकाओं के एक जमा के रूप में प्रकट होता है.
2. साधन पढ़ें: निर्माताओं के निर्देशों का पालन करें, निम्नलिखित निर्देशों को कैसे पढ़ने Vizion मंच के साथ किया होगा की एक उदाहरण हैं:
   1. लॉग इन
   2. "MYCOTB" AST थाली सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
   3. उपयोगकर्ता का सामना करना पड़ रहा बारकोड के साथ सील थाली प्लेस. ग्रोथ turbidity के रूप में या एक अच्छी तरह से नीचे कोशिकाओं के एक जमा के रूप में प्रकट होता है.
   4. पढ़ें विकास को नियंत्रित करता, अगर यह नकारात्मक, reincubate AST microtiter प्लेट है, अगर के पहले अच्छी तरह से साथ प्रत्येक दवा है कि विकास नहीं दिखा है स्क्रीन को छू द्वारा एक सकारात्मक थाली पढ़ा.

पवित्रता प्लेटें पढ़ें. रक्त अगर प्लेट 48 घंटे के बाद कोई विकास नहीं दिखा और 7H10 शुद्धता प्लेट एक जीव प्रकार का मिला हुआ विकास करना चाहिए. यदि दूषित हो, AST microtiter परीक्षण करने के लिए एक शुद्ध संस्कृति से दोहराया जा जरूरत है.

सकारात्मक नियंत्रण से अच्छी तरह से मेज नीचे का उपयोग कॉलोनी मायने रखता है की गणना:

कालोनी गणना कुंजी

माइकोबैक्टीरियम tuberculo के कुछ उपभेदों में पैरा aminosalicylic एसिड के साथ लंबी हो सकता हैबहन. यह सभी कुओं कि छर्रों पर देख रहे हैं और पहले अच्छी तरह से है कि अंत बिंदु के रूप में अगले कमजोर पड़ने के रूप में एक ही आकार गोली का उपयोग करके व्याख्या की जा सकती है. प्रतिरोध के इस दवा के साथ दुर्लभ है.

चित्रा 1. प्रतिनिधि MYCOTB प्लेट का उपयोग कर परिणाम है.

AST microtiter प्लेट है कि सकारात्मक विकास को नियंत्रित करता है की एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है और प्रत्येक दवा के लिए endpoint MIC (μg / एमएल) की परिक्रमा है. हमारी प्रयोगशाला में किए गए एक अध्ययन में संकेत दिया है कि AST microtiter प्लेट विधि सोने माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग की संवेदनशीलता के परीक्षण के लिए मानक अगर अनुपात विधि के बराबर है. परिणामों के तेजी से रिपोर्टिंग microtiter AST microtiter प्लेट के साथ प्राप्त हुई थी जब AST microtiter प्लेट और अगर अनुपात 14 में विधि और 21 दिनों के लिए अंतिम व्याख्या के साथ पारंपरिक अगर अनुपात विधि की तुलना में, respectively.The AST microtiter प्लेट पहले परीक्षण का लाभ है और दूसरी पंक्ति एक साथ दवाओं जो प्रतिरोधी उपभेदों के साथ अत्यधिक देरी को रोकने में मदद कर सकते हैं. AST microtiter प्लेट भी है एपीएम की तुलना में बहुत आसान करने के लिए सेट अप और पढ़ने और दोनों मैनुअल और VIZION जैसे एक अर्द्ध स्वचालित प्रणाली दर्पण प्लेटों को पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. टीबी दवा प्रतिरोध के परीक्षण के लिए एक एमआईसी मूल्य की उपलब्धता "सीमा रेखा पर संवेदनशीलता के साथ उन आइसोलेट्स के लिए विशेष रूप से पारंपरिक महत्वपूर्ण एकाग्रता मूल्य के सापेक्ष चिकित्सकों के लिए मूल्यवान नई जानकारी प्रदान कर सकता है.

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

हम उनकी मदद के लिए अध्ययन के दौरान मेयो क्लीनिक Mycobacteriology प्रयोगशाला की प्रयोगशाला प्रौद्योगिकीविदों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

1. Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., and Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Sept. 12, 2010. Abstract 2450. Presented at 50^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA.
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