The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Oregon Health & Sciences University, 2Department of Pharmacology, University of Colorado Denver
This article is a part of JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).
פגיעה כליות חריפה (AKI) הוא נפוץ, קטלני ביותר, סיבוך של המחלה קריטי שבו יש תמותה גבוה 1-4 ואשר נגרמת לרוב על ידי hypoperfusion, כל הגוף. 5,6 רבייה מוצלחת של hypoperfusion, כל הגוף מודלים מכרסם הייתה רצופת קשיים. 7-9,9,10 מודלים אשר מעסיקים איסכמיה מוקד הוכיחו שוב ושוב את התוצאות שאינן לתרגם להגדרה קליני, במודלים של בעלי חיים גדולים יותר המאפשרים גישה hypoperfusion כל חוסר הגוף הכלים המלא של מניפולציה גנטית אפשרי העכבר. 11,12 עם זאת, בשנים האחרונות במודל עכבר של דום לב ו החייאה התפתחה אשר ניתן להתאים מודל AKI. 13 מודל זה אמין מתרבה פיזיולוגי, התוצאות תפקודית, אנטומית, ו היסטולוגית לראות קליניים AKI , הוא הדיר במהירות, מציע את כל היתרונות המשמעותיים של מודל ניתוח Murine, כולל גישה טכניקות מניפולטיביות גנטי, בעלות נמוכה יחסית לבעלי חיים גדולים, וקלות השימוש. הקבוצה שלנו פיתחה ניסיון רב עם שימוש במודל זה כדי להעריך מספר איברים ספציפיים התוצאות AKI. 14,15
כל ההליכים המתוארים נערכים בהתאם המכונים הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במחקר כל פרוטוקולי חיה אושרו על ידי אורגון לבריאות ומדע באוניברסיטת Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.
1. כירורגי הכנה
2. לב מעצר
3. Exsanguination / זלוף קיבוע ו-Harvest כליה
4. נציג תוצאות:
כאשר CA מושרה, כלומר בלחץ העורקי (MAP) ואת זרימת הדם באזור הכליות (RRBCF) ירידה כמעט לאפס ולהישאר יציבה עד החייאה מתחיל (איור 1). 24 שעות לאחר CA / החייאה, מדדי בסרום של התפקוד הכלייתי (אוריאה דם חנקן, קריאטינין ו BUN) הן גבוהות באופן משמעותי ביחס דמה המופעלים בעלי חיים. AST / ALT גם הן גבוהות, המציע עדות של איסכמיה כל הגוף עמוקה (איור 2). נויטרופילים-gelatinase הקשורים lipocalin (NGAL), אינדיקטור רגיש של פגיעה כלייתית איסכמי הוא מאסיבי 24h שהוגברו לאחר CA / החייאה (איור 3). לבסוף, photomicrographs להדגים את נמק טלוא, מדולרי טיפוסי של פגיעה כלייתית איסכמי עם דילול של האפיתל צינורי ומילוי luminal על hematoxylin ו eosin כתם (איור 4, פאנל) ו מוות של תאים אפיתל רב צינורי מדולרי כאשר מוכתם B-fluoro ירקן ( איור 4, לוח ב).

באיור 1. דום לב גורמת לאובדן מיידי של לחץ זלוף, המיוצג כאן מתכוון בלחץ העורקי (MAP) נמדד בעורק הירך, וכתוצאה מכך הפסקת כמעט מוחלטת של זרימת הדם כליות אזורי קליפת המוח (RRCBF) לאורך התקופה של דום לב (מוצל שטח). החייאה עם לחיצות חזה וחוזר אפינפרין מפה רגילה RRCBF עולה בהתמדה בתקופה שלאחר החייאה. התפרסם באישור 14.

איור 2. 24h postprocedure, אוריאה בדם חנקן (BUN), קריאטינין בסרום, והיקף מוות של תאים צינורי כל גבוהות באופן משמעותי בחיות שעברו CA / החייאה לעומת חיות שטופלו הליך אחיזת עיניים. CA / החייאה גורם עלבון הפאן האורגניזם איסכמי, שעולה כאן על ידי העלאת מסיבית של הכבד לתפקד אנזימים אלאנין אמינו transferase (ALT) ו aspartate aminotransferase (AST) ב-CA / החייאה עכברים לעומת דמה שטופלו בבעלי חיים.

איור 3. ביצע המערבי כתם באמצעות נוגדן polyclonal כדי lipocalin נויטרופילים gelatinase הקשורים (NGAL), אינדיקטור רגיש של פגיעה כלייתית איסכמי. דגימות שתן נלקחו מיד לפני ("קדם") ו - 24 שעות אחרי ("24 שעות") CA / החייאה בתוך 4 חיות (שכותרתו, B, C, ו - ד 'לעיל). NGAL הוא שהוגברו מאסיבית של העכברשתן לאחר CA / החייאה. התפרסם באישור 14.

איור 4.) Hematoxylin ו eosin כתם קטע קצר hilar ציר 24h רקמות כליה לאחר CA / החייאה. אין נזק בלתי סדיר אבל ברור tubules מדולרי ו corticomedullary צינורי עם חיבור. הצבע על חצים tubules פגום עם גרעינים, נפוח pyknotic בצומת corticomedullary. ב) Flouro-B ירקן כתם של האזור באותה חיה עם זאת, 24 שעות לאחר CA / החייאה. Fluoro-ירקן כתמים B תאים נמקי ירוק בהיר, מראה בלתי סדיר נמק צינורי corticomedullary. חצים הצבע בהיר tubules פגום מוכתם בצומת corticomedullary. ממצאים אלה דומים בעיקרם ממצאי ביופסיה כלייתית מבני אדם המפתחים AKI, ושלא כמו אלה המיוצרים על ידי מודלים של בעלי חיים אחרים AKI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
המודל normothermic מדום לב ו החייאה בעכבר מציע דרכים רבות של הערכה במודל אשר משכפל את פתופיזיולוגיה מורפולוגיה של סיבה הקליני השכיח ביותר של AKI, כל הגוף hypoperfusion. בדיקת השערות ניתן בעזרת גישה שריון של טכניקות מניפולציה גנטית את האנטומיה היטב הבין ומאופיינת ופיזיולוגיה של עכבר מעבדה.
כפי שתואר כאן, בידיים מנוסות ההישרדות הוא 80%. למרות ההכנה כירורגית שלאחר מעצרו הם טיפול פשוט, ההחייאה בפועל של העכבר נעצר היא מיומנות כירורגית מאתגרת הדורשת תרגול משמעותי. מניסיוננו, resuscitations מוצלח הפך לנורמה לאחר 30-50 על הניסיונות הראשונים החייאת חיות שונות על ידי מנתח מנוסה, ופגיעה החייאה עקבית לקחת תרגול נוסף. בפרט, בשלב מוקדם של לימוד הטכניקה (כלומר, עבור 20 בעלי החיים הראשונים), הישרדות משמעות סביר, וכל ניצולי צריך להיות מורדמים מיד לאחר החייאה כדי למנוע מצוקה מיותרת. אחרי אימון מוקדם, כאשר ניצולי להפגין התאוששות לב נמרץ בדקות הבאות החייאה, ראוי להמשיך לשרוד חיות דרך לסמן את הפוסט ROSC 15 דקות. בעלי חיים הממחישים נמרץ מאמצי הנשימה הספונטנית על ידי בשלב זה צפוי לשרוד 24 שעות עם התאוששות המתאים. שלב זה בפועל יש להתייחס באופן ספציפי בפרוטוקולים IACUC. המיומנות הקשה ביותר ללמוד היא עיסויי חזה עצמם קשה כדי לספק עיסויים בקצב הדרוש מבלי להגדיל את רמות הלחץ מזיק. Resuscitators מכונות כבר המציאו והשתמשו במעבדה שלנו ועוד 16 אך עד כה לא ההחייאה מכני העכבר הפיק הישרדות מקובל.
יש כמה מגבלות המודל הזה. ראשית, אין מודל העכבר יכול במלואה מודל הפיזיולוגיה האנושית, והתוצאות צריך לפרש עם כבוד interspecies ההבדלים. בפרט, את הלב העכבר חזקים, אנחנו להשיג 80% הישרדות ב 8 דקות של דום לב, אך מחקרים קליניים ההישרדות האנושי הוא פחות מ -50% אפילו עם החייאה התחלה 2-3 דקות לאחר מעצרו 17 גודלו הקטן של העכבר. מעבד ההליכים הקפדניים מבחינה טכנית, יש עקומת למידה משמעותית, במיוחד עבור לחיצות חזה. שנית, בפרוטוקול זה, התרופה במינונים והגדרות ההנשמה לא צמודים משקל החיה. זה בגלל שאנחנו משתמשים בחיות רק בטווח של 20-25 גרם במשקל על מנת למזער את ההשפעה של גודל הציוד. לדוגמה, אנו משתמשים קטטר 22 מד לצנרר קנה הנשימה, את החותם שהושג אינו זהה העכבר 30 גר 'כפי שהוא עכבר 25 גרם לבין דליפת גז מוגברת יכולה להיות משמעותית מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, את השימוש בבעלי חיים במגוון משקל מוגדר אינו לשחזר בנאמנות את מגוון השיעורים גוף חשופים לפגיעה איסכמיה reperfusion קליניים. שלישית, המדינה לא תזרים בנאמנות לא יכול לשחזר את התוצאות של זרימה נמוכה מדינות. בפרט, עלולים לפתח חום הדרגתיים בתוך העכבר במהלך זרימה לא. כדי למזער את ההשפעה (אם בכלל) של gradients על התוצאות, טמפרטורה נמדדת ליד האורגן של עניין. לבסוף, בשל נתונים מוקדם מן המעבדה שלנו אשר אישר חמצת מטבולית משמעותי בתקופה postarrest, אנו ע.ד. במהלך החייאה. כאשר הנתונים האחרונים מצביעים על כך היפרוונטילציה במהלך החייאה היא מזיקות, 18,19 זה אפשרי כי פרקטיקה זו מפחיתה הישרדות במודל. מודלים רבים חלופות לפגיעה כל הגוף reperfusion איסכמיה להתקיים. לדוגמה, CA / החייאה תוארה אצל כלבים, ארנבות 20, 21 כבשים, 22 חזירים, 23 עכברים, 16 ו סנאים הארקטי הקרקע. 24
הראינו כי תפקוד כלייתי לאחר הניתוח עשוי להיות מוערך על ידי מספר כימיים, מערכת החיסון, או טכניקות היסטולוגית לאחר 24 שעות. בעלי חיים יכול להיות שרד יותר מ 24 שעות, לעומת זאת, ואת אופי חולף של AKI עושה את זה מודל אטרקטיבי לשימוש חקירה של מנגנוני ההתאוששות ו / או פגיעה לצמיתות. הפגיעה עצמה היא titratable על ידי שינוי הפרמטרים של זמן וטמפרטורה במהלך CA. מאסרים ארוכים ותחזוקה של טמפרטורות גבוהות יותר לייצר פגיעה גדולה יותר (אך השפעה לרעה על ההישרדות). כפי שהראינו עם הנתונים לתפקד כלל הכבד, מערכות איברים אחרים מושפעים גם ועשוי להיחקר באמצעות עיבודים של מודל זה, עם זאת, ניכר מאמץ שיידרש כדי למטב את תנאי הניסוי של מערכת איברים של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Abbott Laboratories | 06653-5 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 (and others) | |
| Epinephrine HCl | Multiple Suppliers | Multiple | |
| Digi-Sense temperature controller | Cole-Parmer | EW-89000-00 | |
| Angiocath IV Cath | VWR international | 381134 | |
| Frova angled airway introducer | Cook | G27282 | |
| MicroVent Ventilator for Mice | Harvard Apparatus | 733591 |