Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

1. Isolamento di arteria mesenterica piccolo ratto

1. Anestetizzare animali con isoflurano in una camera chiusa e pulire l'addome con l'alcol.
2. Eseguire una linea mediana laparotomia per esporre letto mesenterica.
3. Utilizzando le forbici, rimuovere circa 85 cm di intestino con l'alimentazione vasi con l'arteria mesenterica superiore. Tagliare l'estremità prossimale della sezione intestinale vicino al piloro e la fine distale vicino alla giunzione ileo-coecal. Segmenti dell'intestino sono isolati da topi che sono profondamente anestetizzati con isoflurano e eutanasia da open-torace puntura cardiaca.
4. Situato sezione asportato in un piatto rivestito di Petri contenente PSS ed eseguire la dissezione dell'arteria mesenterica a temperatura ambiente.
5. Fissare l'estremità prossimale dell'intestino sul lato destro e pin out il resto del senso antiorario intestineina (fine ieproximal sul sistema vascolare alimentazione sinistra dall'altra parte dell'intestino).
6. Sezionare il ramo II e III segmenti insieme con un pezzo del segmento prossimale.
7. Sezionare la vena e isolare l'arteria (con a forma di V punto di diramazione) e pulirlo, rimuovendo il tessuto connettivo e adiposo. Evitare il contatto diretto con l'arteria tirando delicatamente con una pinza e taglio attraverso la membrana del tessuto connettivo.

2. Montaggio della nave

1. Tagliate due segmenti brevi (≈ 4 cm) di 40 micron di tungsteno senza filo di acciaio inossidabile e, con una pinza sottile, inserire uno nel lume di ogni arteria facendo attenzione a non danneggiare l'endotelio. Utilizzare la punta del filo per aprire il lume, se necessario. Grondante di sangue fuori dal vaso è un buon segno il lume è aperto.
2. Riempire la camera miografo con soluzione salina fisiologica (PSS; mM: 115 NaCl, 4.7 KCl, 1,4 MgSO ₄ 0,7 H ₂ O, 5 NaHCO _3, 1,2 K ₂ HPO _4, 1,1 Na ₂ HPO _4, 1,0 CaCl _2, 20 e HEPES 5 glucosio, pH 7,4) con l'acido ascorbico (100 mM) a 37 ° C e con pinze trasferire accuratamente l'segmento filettato nave dalla capsula di Petri nella camera a temperatura ambiente e trasferire il segmento asportato nave prossimale alla camera miografo e tirare la finale lungo il cavo di alimentazione in vaso. Evitare allungamento della nave.
3. Fissare la fine vicina del filo in senso antiorario con la vite di fissaggio vicino sulla destra mascella collegato al micrometro. Prendere l'estremità libera del filo con una pinza e sicuro in senso orario sotto la vite di fissaggio molto sulla destra della mandibola. Assicurarsi che il segmento nave lungo il filo si trova nello spazio tra le fauci senza alcun contatto con la stessa mascella.
4. Avvitare le mascelle a parte, e allineare la seconda parallela filo con la nave e inserirlo nel fondo del lume. Delicatamente il filo di alimentazione attraverso il lume del segmento di vaso in un unico movimento con il filo già montato come una guida. Tenere il filo di circa 1 cm dalla nave per evitare che si estende durante la manovra, ed evitare di toccare l'endotelio.
5. Avvitare le mascelle insieme e garantire che si muove secondo filo di montaggio sotto il primo fissato sulla destra della mandibola.
6. Fissare la fine vicina del secondo filo in senso orario, sotto la vite di fissaggio vicino di sinistra mascella collegato al trasduttore.
7. Fissare l'estremità del filo sotto la vite di fissaggio sulla mascella a sinistra e stringere per allungare il filo.
8. Una volta che il montaggio è completo, ripristinare il motore nel "Menù di montaggio" e avviare la normalizzazione della nave.

3. Normalizzazione

Il Dual miografo Wire Auto System-510A ha una funzione automatica di normalizzazione, che è valutato dal menu "normalizzazione" e permette alla barca di essere allungato per una circonferenza normalizzato interno da una procedura standardizzata secondo il protocollo del produttore dopo equilibrazione per 30 minuti a 37 ° C. Una curva esponenziale è poi sistemare i dati di pressione interna circonferenza. La procedura definisce il diametro del lume (d 100) che l'arteria avrebbe avuto in vivo quando rilassato e sotto una pressione transmurale di 100 mmHg ¹ La normalizzazione dei parametri per l'arteria mesenterica topo sono come segue.

1. Pressione transmurale obiettivo = 13,3 kPa (100 mm Hg).
2. Tempo = 60 sec; Durata di ciascuna delle fasi normalizzazione.
3. IC ₁ / IC ₁₀₀ = 0.9 (IC ₁ = circonferenza interna normalizzato, IC ₁₀₀ = circonferenza interna corrispondente alla pressione di destinazione.
4. Calibrazione oculare 2 * Δ (mm / oculare divisione), 2 delta è per ragioni di programmazione.

Misurare la lunghezza dell'arteria mesenterica montata usando l'oculare letture microscopio quando i filetti sono oltre le estremità vicine e lontane del segm nave montataent. In breve, la lunghezza del segmento di vaso montato è misurata al massimo ingrandimento di un oculare calibrato oculare del microscopio dissezione. L'oculare di lettura con i capelli-line sul fondo del segmento (a ₁₎ e la fine vicina del segmento (a ₂₎ nelle divisioni oculari sono misurati e registrati. Questi valori, con le letture micrometro, prima e dopo l'allungamento della nave vengono registrati e inseriti nel menu del programma per calcolare la curva arredata e il diametro interno corrispondente alla pressione transmurale obiettivo di 100 mm Hg

Nei nostri studi, le arterie sono stati fissati per il diametro del lume di d ₁ = 0,9 xd _100, dove lo sviluppo forza attiva è massima. Sviluppo della forza attiva di ≥ 10 mN nelle arterie mesenteriche ratto è considerato ottimale per gli esperimenti di procedere. Tessuti con minore forza attiva sono stati scartati.

4. Misurazione di risposte

Dopo la normalizzazione, le proprietà meccaniche e funzionali dei vasi sono riattivate eseguendo un "avvio standard", che coinvolge vasi impegnativo con ripetute applicazioni (in genere 2 o 3) su 5 fenilefrina mM (PE) per ottenere contrazioni riproducibile. Un tipico "start standard" nel nostro laboratorio è costituito da una serie di stimoli e di periodi di washout come segue:

1. Sostituire camera miografo coperchio e iniziare aerazione con il 95% di aria e il 5% di CO _2.
2. Riempire da camera con PSS fresca (contenente 100 mM acido ascorbico)
3. Nave contratto con mM PE 5 per 5 minuti e lavare 4 volte con tampone PSS.
4. Dopo l'ultimo lavaggio, camera ricarica con PSS ed attendere 3 minuti prima di ripetere passi (ii) e (iii).

Dopo l'avvio standard, l'arteria è pronto per l'esperimento. Rilassamento dei vasi contratto sono valutati da oltre cumulativo di concentrazioni crescenti di CaCl ₂ (0,5 - 4 mm). Navi quando inibitori sono utilizzati sono pre-incubate con i composti nella camera miografo per 20 minuti e presente durante il test.

5. Analisi dei dati

La "normalizzazione" dei dati per le navi e tracciati forza, direttamente convertiti in dati di testo, sono stati analizzati con il 11,0 SigmaPlot grafico del programma (SYSTAT Software, Point Richmond, CA) e tracciati, come mostrato nella Figura 1. Dati concentrazione-risposta, calcolato dal tracciato, sono state analizzate determinando CE ₅₀ valori da dati sperimentali montato su un quattro parametro della funzione logistica nel menu di Farmacologia del programma. I confronti tra i gruppi e all'interno dei gruppi sono stati eseguiti da una analisi della varianza (ANOVA) e le differenze con p 0.05 <sono considerati significativi.

6. Rappresentante dei risultati:

* La differenza tra i valori di L _{100 del} Wistar e DR sono statisticamente significative. Shapiro-Wilk Test di normalità passato (p = 0,588); test varianza pari passato (p = 0,237).

L ₁₀₀ = diametro interno del segmento montato corrispondente alla pressione transmurale bersaglio.

X ₁ = L'impostazione posizionatore micro necessari per allungare la nave montati al suo interno circonferenza normalizzato (ovvero il valore della lettura micrometro al quale sono stati eseguiti esperimenti).

r ² = coefficiente di regressione per eccesso di (X _i, Y _i) una curva esponenziale.

NB: La procedura dettagliata è descritta nel manuale per il sistema 510A miografo ^6.

Tabella 1. Esempio di lettura dei parametri di normalizzazione per i segmenti di arteria mesenterica da Wistar, DS e DR da programma base indicato nel "Menù normalizzazione". I valori sono medie (± SEM) di 5 animali. * Le differenze tra i valori di L _{100 del} Wistar e DS sono statisticamente significativi (p <0,05).

Tabella 2. Tensioni sviluppati (MN), in arterie mesenteriche isolato dal Wistar, DS e ratti DR, in seguito alle domande su 5 mM PE per ogni nave. Valori riportati sono mezzi (± SEM) di 6-8 animali. * Significativamente diversi dai controlli Wistar (p <0,05).

Figura 1. Ca ^{2 +} _e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un ratto Wistar montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca ^{2 +.} L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca ^{2 +} _e determinato. Una forza rappresentativa tracciamento con l'aggiunta di 5 micron PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca ^{2 +} è mostrato.

Figura 2. Ca ^{2 +} _e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un topo DS montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca ^{2 +.} L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca ^{2 +} _e determinato. Una forza rappresentativa tracciamento con l'aggiunta di 5 micron PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca ^{2 +} è mostrato. Ca ^{2 +} il relax è stata gravemente compromessa in questo tessuto rispetto a quelli di ratti Wistar e DR.

Figura 3. Ca ^{2 +} _e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un topo DR montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca ^{2 +.} L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca ^{2 +} _e determined.A forza di riferimento analisi su aggiunta di 5 mM PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca ^{2 +} è mostrato.

Figura 4. A. [Ca ^{2 +]} _{e curve} di risposta. Grafico a barre che mostra B. CE ₅₀ valori per il relax determinata inserendo i dati di un'espressione quattro curve.C.CaR parametri logistici nelle sale giochi mesenterica isolati da topi DR e DS.

L'ipertensione è una delle principali cause di morbilità cardiovascolare, cerebrale e renale / mortalità. L'incidenza di ipertensione è alta nella popolazione e sensibili al sale ipertensione è particolarmente elevato nella popolazione, e più frequente nei neri rispetto ai bianchi. Questo si ritiene sia dovuta alla tendenza dei neri a trattenere sodio nei reni ^9. Sale-sensibilità è un fattore importante che contribuisce alla malattia renale ed è associata a disfunzione endoteliale, ma il meccanismo non è completamente nota. Recenti studi nel nostro laboratorio hanno rivelato che le diete di sale ridurre liquido interstiziale Ca ^{2 +} concentrazione ([Ca ^{2 +]} _SE), e aumento della pressione sistolica di sale-sensibile ratti ^10,11. Questi effetti possono essere attribuiti a ridotta espressione di automobili in arterie mesenteriche e kidneys.Finding riduzioni simili nei livelli di auto in pazienti ipertesi sensibili al sale potrebbe fornire un bersaglio per lo sviluppo di nuove terapie. Abbiamo utilizzato il myography automatizzati filo con isolati arterie mesenteriche da una serie di modelli animali di ipertensione per studiare la reattività vascolare a Ca ^{2 +} _e di capire il meccanismo di CaR segnalazione nel sistema vascolare.

[Ca ^{2 +]} _e viene mantenuta in un intervallo ristretto (1,1 - 1,4 mm) negli esseri umani ^12, quindi la vettura deve essere in grado di rilevare piccole variazioni [Ca ^{2 +]} _e per l'attivazione dei recettori sia possibile. Infatti, la vettura ha dimostrato di poter individuare piccoli cambiamenti di Ca ^{2 +} _e ^13, e piccoli aumenti di [Ca ^{2 +]} _SE che sono all'interno del range fisiologico ^14. Negli studi di microdialisi in situ di misura [Ca ^{2 +]} _SE nel sottomucosa duodenale e reni corteccia, due tessuti che sono essenziali per la regolazione della resistenza periferica e della pressione sanguigna (BP), ha mostrato cambiamenti dinamici in funzione del lume intestinale [Ca ^{2 +].} Aumentando nell'intestino [Ca ^{2 +]} da 0 a 6 mm, ha aumentato la [Ca ^{2 +]} _SE 1,1-1,9 mM ^4,5,15, che si trova nel range osservato per attivare il CaR nervose perivascolari ^16, e rilassarsi mesenterica isolata arterie ^17. Abbiamo anche dimostrato che la vettura rileva diminuzioni [Ca ^{2 +]} _e e aumentare la durata del potenziale d'azione attraverso l'attivazione del canale non selettivo zione, che a sua volta attenua l'impatto sulla probabilità di distacco presso i terminali neocorticale ^18. Questo suggerisce che la vettura offre pre-sinaptica feedback per alterare l'eccitabilità del cervello in risposta a Ca ^{2 +} _e. Inoltre, desensibilizzazione del CaR PVN si verifica con ripetuti, la stimolazione prolungata ^16, suggerendo che la comprensione del regolamento di questo recettore chiarirà il suo ruolo sia in condizioni normali e ipertesi. Bukoski e colleghi hanno dimostrato che piccole variazioni [Ca ^{2 +]} _SE sono sufficienti per attivare il CaR e contribuire alla sintesi vasodilatatore in condizioni normali ^3,4.19,. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo postulato che questa risposta si verifica anche in condizioni di aumentato tono vascolare come si vede nella ipertensione e può quindi essere sfruttato per controllare la pressione sanguigna. Lo studio di attivazione CaR e come questo porta alla fosforilazione di intermedi di segnalazione è, quindi, necessaria per sondare il suo ruolo nella fisiologia normale e ipertesi. L'auto è G protein-coupled recettore (GPCR) ed è regolata attraverso meccanismi simili a quelli di altri GPCR, che sono comuni bersagli terapeutici. Pertanto, la comprensione dei meccanismi della sua regolazione nei vasi sanguigni fornirà dati utili per determinare il suo potenziale come bersaglio per la terapia anti-ipertensiva.