Подкожного введения мускариновых антагонистов и Triple-Иммуноокрашивание из Лонг Levator Auris мышц у мышей

1. Подкожное введение ацетилхолина мускариновых рецепторов (mAChR) антагонисты

1. Подготовка в асептических условиях соответствующую дозу mAChR антагонист (см. таблицу) путем растворения препарата в стерильном физиологическом растворе в 1,5 мл трубки реакции. Следующие антагонистов были использованы: атропин, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, МТ 7.
2. Ничья 50 мкл раствора в шприце a1cc инсулина и использовать отдельный шприц для каждой мыши. Также приготовьте шприцами содержащие физиологический раствор только для каждой мыши в контрольной группе. Держите шприц по льду до готовности внедрить.
3. Обезболить мышей с кетамином ксилазина коктейль (120 мг / кг кетамина, 8 мг / кг ксилазина) Проверьте соответствующие глубины анестезии, наблюдая отсутствие реакции на ноги крайнем случае.
4. После правильной седативный эффект, брить волосы покрытие ростральной области головы до хвостового области шеи, протрите оставшиеся волосы от 70% этанола.
5. Наведите под стереомикроскопа и вставить иглу параллельно LAL мышцу в то время как подтягивание слегка на иглу шприца (рис. 1а, б). Это гарантирует, что игла вводится в вышележащих соединительной ткани и непосредственно не повредить LAL мышцы. Вставьте иглу так, чтобы кончик крышки хвостового аспект LAL мышцы.
6. Очень медленно начинаю вводить раствор на право LAL мышц при выводе шприц, и общее время инъекции должна быть примерно 1 минуту. Если вводится должным образом, решение должно стать "Купол", что составляет примерно 1 см в диаметре, в вышележащих кожи, которые будут оставаться, по крайней мере один час. Равномерно вводят раствор покроет всю ростральной и хвостовой регионам право LAL мышцы.
7. Повторяйте процедуру каждые 12 часов от 1 до 7 дней. Для других studies1, мы использовали тот же протокол для введения факторов роста, каждые 12 часов на срок до 21 дней. Нет ненормальные ответы наблюдались у мышей вводили наркоз 2x в день на срок до 21 дней.

2. Препарирование LAL мышцы

1. Усыпить мышей с передозировкой натрия фенобарбитала (390 мг / кг). Смерть обеспечивается оценки отсутствие сердцебиения после торакотомии выполняется.
2. Придавить мыши в рассечение блюдо, сверху с 1 штифт в каждой лапе и 1 контактный через нос.
3. Сделайте первый разрез через кожу только, используя маленькие ножницы весны до разрезать вдоль левого LAL из региона только проксимальнее ухо к области вокруг левой лопатки.
4. Осторожно снимите кожу в этом регионе, но и избежать сокращения слишком близко к правому уху, поскольку это является одной из точек привязки на право LAL мышцы.
5. Найдите по центру полосы жировой ткани липидного вдоль средней линии, на поверхностный поверхности головы, где правые и левые мышцы LAL с концами. Использование маленькие ножницы весной, вырезать 1 см справа от жировой ткани (в сторону левого уха) от проксимального края левой LAL мышц до достижения плеча (рис. 1в).
6. Как только разрез делается, отогните право LAL мышцы с небольшой пинцет, чтобы разоблачить брюшной стороне мышцы. Trim соединительной ткани и фасции при тщательном подтягивание на право LAL мышц щипцами (рис. 1в).
7. Вырезать вокруг хвостовой конец правой LAL у основания уха. Продолжить резки, двигаясь в направлении ростральной конце правым ухом, сохраняя право LAL перевернулся (рис. 1в).. Лучше, чтобы включать больше ткани на этот шаг, чем рискуете повредить сам LAL. Если мышца начинает иссякать, пипетка 1X PBS в течение мышцы.
8. Место расчлененный право LAL в 30 мм культуры Sylgard блюдо с 1X PBS, спинной стороной вверх. Придавить четырех углах мышцы с небольшим контактов насекомого.
9. Используя небольшие щипцы и ножницы весной, чистая соединительная ткань из спинной и брюшной поверхности правой LAL мышцы. Включите мышцы снова и снова контактный для того, чтобы счистить брюшной поверхности. 2-3 мышцы могут быть размещены в том же 30-мм блюдо.

3. Тройной иммуноокрашивания из LAL NMJs: День 1

1. Перед началом иммуноокрашивания, подготовить все необходимые реагенты. 1X PBS, 2% бычьего сывороточного альбумина BSA) / PBS, 0,1 М глицина в 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 в 2% BSA / PBS, и 4% параформальдегида (PFA) в 1X PBS будет необходимо. Предварительное охлаждение метанола в морозильной камере -20 ° C.
2. Оставьте LAL мышцы закреплен в сторону спинного блюдо во время этого процесса. Отменить решение 1X PBS и добавьте достаточно 4% (PFA) для покрытия мышцы. Место блюдо на шейкере при скорости набора 2 или 3 в течение 20 минут. Если не указано иное, блюдо должно быть уделено шейкер для следующих шагов.
3. Отменить 4% PFA и мыть мышцы с 1X PBS 3 раза, 10 'каждая.
4. Отменить последнее 1X PBS вымыть и добавить 0,1 М глицина в 2% BSA / PBS решение для 30 '.
5. Отменить 0,1 М глицин решениеD Добавить 1X PBS содержащего родамина сопряженные α-бунгаротоксина в концентрации 1:200 для 15 '.
6. Отменить α-бунгаротоксина решение и мыть мышцы в 1X PBS, 3 раза 10 'каждая.
7. Permeabilize ткани, добавив предварительно охладить метанол и место блюдо в морозильной камере -20 ° С в течение 5 минут, точно, не качая необходимости.
8. Удалить метанола и промыть 3 раза 10 'каждый 1X PBS. Отменить последнее мыть и блок ткани с 0,2% тритона Х-100 в 2% BSA / PBS в течение 1 часа. Мытье и блокирование действия выполняются при комнатной температуре.
9. Инкубируйте мышцы за одну ночь, дрожа, при 4 ° С в коктейль из первичных антител разводят в блокирующий раствор (см. таблицу).

4. Тройной иммуноокрашивания из LAL NMJs: День 2

1. Вымойте мышцы 1X PBS 3 раза, 10 'каждый при комнатной температуре.
2. Добавить коктейль из вторичными антителами в блокировании решения в течение 1 часа при комнатной температуре (см. таблицу). Мышцы должны быть защищены от света от этого шага вперед, чтобы предотвратить фото-отбеливание Alexa Fluor 647-флуоресценции.
3. Вымойте мышцы 1X PBS 3 раза, 10 'каждая.
4. Очистите все оставшиеся соединительной ткани в 1X PBS, вырезать боковые границы LAL мышцы и смонтировать на слайдах спинной стороной вверх, с использованием стеклянной крышкой-квитанции и монтаж средств массовой информации. Используйте ясный лак для ногтей обеспечить покрытие скольжения на месте.
5. Защита слайды от света и хранить при -20 ° С до готовности для анализа.

5. Конфокальной изображений LAL NMJs

1. Высокое разрешение конфокальной изображения, полученные с планом Leica Apo 63x нефти цели (1.4NA) на Leica TCS 4D конфокальной микроскопии.
2. Флуоресцеина и Alexa 647 сигналов одновременно были отсканированы с лазерных линий 488 нм (аргон, 488 нм, 20 мВт) и 633 нм (гелий-неоновый, 633 нм, 10 мВт), соответственно. Последовательно, родамина сигнал затем сканируется с лазерной линии 561 нм (DPSS, 561, 20 мВт). Оптический разделы были собраны на 0,3 мкм интервалы и количество изображений в г-плоскости колебалась от 60-80. Обскуры настроен на Эйри 1 (107,97 мкм). Формат изображения 1024 x 1024 (X, Y), при этом коэффициент увеличения на 1, на 400 Гц результаты скорости в изображении размером 234,32 мкм и длиной 234,32 мкм и размером пикселя 229,05 нм х 229,05 нм.
3. Leica TCS-NT приобретение программного обеспечения затем используется для восстановления Z-серии изображений в максимальной проекции интенсивности.
4. Multipanel изображения с учетом яркости и контрастности использованием Adobe Photoshop.
5. Для типичного LAL мышцы, надо уметь анализировать примерно 75-100 NMJs фас. Synaptic устойчивость определяется функций, таких как пространственное выравнивание пре-, пери-и постсинаптических элементов (т.е. нерва, Шванн клеток и мышц), а измерения синаптической области (то есть, синапс размера).

Представитель результаты:

На взрослых млекопитающих NMJ, одного аксона двигатель развивает тонкой ветви, которые формируют высоко дифференцированного беседки из нервного окончания (рис. 2, зеленый) по одному волокну мышцы, точно соединенный с постсинаптической кластеров никотиновых АХР (рис. 2, Red) . Perisynaptically, терминал Шванн клетки плотно охватывают все отрасли пресинаптических нервных окончаний (рис. 2, синий). Структурную и функциональную целостность этой трехсторонней организацией сильно возмущенный ежедневного применения подтип-специфических ингибиторов mAChR. В примере, приведенном здесь (рис. 3), 4-DAMP, mAChR антагонист с высоким сродством к M1, M3, M4 и M5 mAChR подтипы, вызывает селективное устранение нервных окончаний от многочисленных NMJs всей мышцы поверхности (рис. 3Б, С). Кроме того, терминал Шванн клетки аномально покоя ^8, о чем свидетельствует яркая маркировка S100 без процесса расширения (рис. 3B ", 3C"). Postsynaptically, мышечные волокна являются нормальными и нет потери nAChRs (рис. 3B, 3C ").

Рисунок 1. Анатомическое расположение и организация LAL мышцы. Расположение ростральной (rLAL), хвостовой (Клаль) и LAL нерва (LALn) и соответствующих полос концевой пластинки показаны (А, вставка). Местоположения и ориентации иглы по отношению к LAL мышц показана для инъекций порядок (Б). Разрез точками показаны для вскрытия процедуры (С).

Рисунок 2. Трехсторонней организации NMJ. Высокая увеличение конфокальной вид мыши NMJ. Одного аксона разрабатывает тонкой ветви терминал (), плотно покрыта терминал Шванн клеток и их процессов (', звездочки указывают на терминал органов Шванн клетки). Postsynaptically в мышечное волокно, кластер никотиновых АХР именно соединенный с ветвей нерва TERMIсигналы и терминальные Шванн клеток.

Рисунок 3. LAL мышцы обрабатывают 4-DAMP, mAChR антагонистом. Низкого и высокого увеличения конфокальной видом LAL мышцы получавших транспортного средства или 4-влажный. В отличие от автомобиля обработанной мышце (-'''), многочисленные NMJs в 4-DAMP обработанной мышце отсутствие нервных окончаний (В-В''', С-С'''). Коробках области на рисунке 2B увеличена на рис 2С.

Метод, представленный здесь позволяет исследовать ранее неизвестные роли подтипа конкретных mAChR сигнализации в стабильности и поддержание млекопитающих NMJs. Этот метод также будет полезна для проверки эффектов нейротрофических факторов и фармакологических агентов. Например, наши лаборатории обнаружили, что цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) вызвало прорастание почти из всех LAL нервных окончаний у взрослых мышей 1 . Этот результат контрастирует с предварительного исследования CNTF обработанных задних мышц конечностей, в котором сообщалось умеренной прорастания на ок. 13-33% от ягодичной и в 9% от боковых икроножных переходов ^3. Мы считаем, расхождение за счет более равномерного и длительного воздействия на нервные окончания в CNTF в LAL, чем в мышцах задних конечностей. Действительно, когда мы обратились к боковым CNTF икроножной и передней большеберцовой мышцы, используя тот же протокол, который вызвал широкое прорастания почти из всех LAL NMJs, мы наблюдали слабую прорастание только из небольшого числа NMJs, которая была преимущественно расположенных вблизи места инъекций. Судя по всему, воздействие NMJs задних конечностей к CNTF были ограничены и неравномерно, что также указывалось в предыдущем исследовании 2 . С другой стороны, CNTF вводят между подкожной соединительной ткани и LAL фасции, но не CNTF вводят подкожно в задних мышц конечностей, формируется местный, подкожный отек, который сохраняется в течение по крайней мере за один час до сосудистой реабсорбции. Следует также отметить, что даже при инъекции частота CNFT или mAChR антагонистов была увеличена до четырех раз в день, мы не наблюдали особенно эффект суммирования CNTF и mAChR антагонистами. Кроме того, если инъекция процедура выполняется соответствующим образом, маловероятно, что какой-либо прямой ущерб мышц будет происходить. Тем не менее, если кто-то повреждение мышцы во время инъекции процедуры аксонального прорастания нерва на терминале или в узлах и / или дегенерации мышечных волокон можно было наблюдать ^1,8. Таким образом, LAL мышцы уникальный препарат, который позволяет форме, длительное воздействие всех NMJs в мышцах с относительно простой и быстрый процедур.

Узкой хвостовой части LAL мышцы толстые (3-5 мышечных волокон толстой), чем более широкий ростральной части (2-3 мышечных волокон толщиной). Соответственно, NMJs связаны с мышечными волокнами глубоко расположены в хвостовой LAL часто либо не помечены в wholemount иммунной или маркированы только α-бунгаротоксина, которое проникает глубже, чем антитела, из-за меньшего размера и высоким сродством к nAChRs. Эти NMJs может быть неверно истолкован как потеряв нервных окончаний или Шванн клетки из-за специфических эффектов применяемых лекарств. Поэтому важно отметить, являются ли эти переходы наблюдаются только в хвостовой LAL, и является ли NMJs или мышечные волокна поверхностно или глубоко расположена: поверхностно расположены мышечные волокна, как правило, связано с гораздо более высокой, чем фон иммунофлюоресценции глубоко расположены волокна. Кроме того, можно опустить глубоко позиционируется NMJs в хвостовой полосе LAL из wholemount анализа.

Хотя полная перерезка нервов LAL относительно легко и позволил нам изучить последствия mAChR торможение на денервированных мышцы, размер и доступность LAL нервы ограничить виды хирургических подходов, которые могут быть исследованы. Например, частично повреждения LAL силы, чтобы заставить частичной денервации мышц LAL кажется технически довольно сложной задачей.