Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

1. Die subkutane Verabreichung von Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten

1. Bereiten Sie unter aseptischen Bedingungen die entsprechende Dosis von mAChR-Antagonist, (vgl. Tabelle), indem man das Medikament in steriler physiologischer Kochsalzlösung in 1,5 ml Reaktionsgefäß. Die folgenden Antagonisten wurden verwendet: Atropin, Methoctramin, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
2. Draw 50 ul Lösung in a1cc Insulinspritze und eine separate Spritze für jede Maus. Auch bereiten Spritzen mit physiologischer Kochsalzlösung nur für jede Maus in der Kontrollgruppe. Keep Spritzen auf Eis, bis die Injektion bereit.
3. Anesthetize Mäuse mit Ketamin-Xylazin-Cocktail (120 mg / kg Ketamin, 8 mg / kg Xylazin) Check für eine angemessene Narkosetiefe durch die Beobachtung Mangel an Reaktion auf Prise Zeh.
4. Nach ordnungsgemäßer Sedierung, rasieren Behaarung des rostralen Bereich des Kopfes bis zum kaudalen Bereich des Halses, wischen restlichen Haare weg mit 70% Ethanol.
5. Bewegen Sie die Maus unter Stereomikroskop, und legen Nadel parallel zur LAL Muskel während Hochziehen leicht auf die Nadel der Spritze (Abb. 1A, B). Dies gewährleistet, dass die Nadel in darüber liegenden Bindegewebes eingesetzt wird und nicht direkt beschädigt LAL Muskel selbst. Führen Sie die Nadel so, dass die Spitze deckt den kaudalen Bereich des LAL Muskel.
6. Ganz langsam beginnen, Lösung über das Recht LAL Muskel injizieren, während Zurückziehen der Spritze, die insgesamt Injektion sollte etwa 1 Minute. Wenn injiziert richtig, sollte die Lösung bilden eine "Kuppel", die etwa 1 cm im Durchmesser ist, in die darüber liegende Haut, die für mindestens eine Stunde bleiben. Ein gleichmäßig eingespritzt Lösung deckt den gesamten rostralen und kaudalen Regionen der rechten LAL Muskel.
7. Wiederholen Sie den Vorgang alle 12 Stunden für 1 bis 7 Tagen. Für andere Studien1 benutzten wir das gleiche Protokoll zu injizieren Wachstumsfaktoren alle 12 Stunden für bis zu 21 Tage. Keine anormalen Reaktionen wurden von Mäusen mit Narkose 2x pro Tag für bis zu 21 Tage verabreicht wird.

2. Dissection von LAL Muskeln

1. Euthanize Mäuse mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (390 mg / kg). Der Tod ist durch die Beurteilung Mangel an Herzschlag nach Thorakotomie durchgeführt wird gewährleistet.
2. Pin Sie die Maustaste in eine Sektion Gericht, Dorsalseite mit Pin 1 in jeder Pfote und 1 Stift durch die Nase.
3. Machen Sie den ersten Schnitt durch die Haut nur mit kleinen Feder Schere zu schneiden entlang der linken LAL aus der Region nur proximal an das Ohr, um die Region rund um das linke Schulterblatt.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Haut in dieser Region, aber vermeiden Schneiden zu nahe an das rechte Ohr, da dies eine der Ansatzstellen für das Recht LAL Muskel.
5. Suchen Sie den mittig platzierten Fettgewebe Streifen Lipid entlang der Mittellinie auf der äußeren Oberfläche des Kopfes, wo rechts und links LAL Muskeln zu erfüllen. Mit kleinen Feder Schere, schnitt 1cm auf der rechten Seite das Fettgewebe (in Richtung des linken Ohres) vom proximalen Rand der linken LAL Muskel bis zum Erreichen der Schulter (Abb. 1C).
6. Sobald der Schnitt gemacht, Ziehen Sie die richtigen Muskeln LAL mit kleinen Zange auf die Bauchseite des Muskels freizulegen. Trim das Bindegewebe und Faszien während vorsichtiges Ziehen an der rechten LAL Muskel mit einer Pinzette (Abb. 1C).
7. Cut um den kaudalen Ende des rechten LAL an der Basis des Ohres. Weiter Schnitt, Bewegung in Richtung des rostralen Ende des rechten Ohres, halten das Recht LAL umgedreht (Abb. 1C).. Es ist besser, mehr Gewebe bei diesem Schritt als Gefahr der Beschädigung der LAL selbst gehören. Wenn der Muskel beginnt zu trocknen, Pipette 1X PBS in den Muskel.
8. Legen Sie seziert Recht LAL in 30mm Kultur Sylgard Schale mit 1X PBS, Rücken nach oben. Pin unten vier Ecken des Muskels mit kleinen Insekten Pins.
9. Mit Hilfe von kleinen Zangen und Scheren Frühjahr, sauber Bindegewebe aus dorsalen und ventralen Flächen der rechten LAL Muskel. Schalten Muskel wieder und wieder-pin, um sauber aus Ventralfläche. 3.2 Muskeln können in der gleichen 30mm Schale gelegt werden.

3. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 1

1. Vor Beginn der Immunfärbung, bereiten alle notwendigen Reagenzien. 1X PBS, 2% Rinderserumalbumin BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS benötigt werden. Pre-cool Methanol in -20 ° C Gefrierschrank.
2. Lassen Sie LAL Muskeln in der Schüssel Dorsalseite während dieses Prozesses merken. Discard 1X PBS-Lösung und fügen genug 4% (PFA), um den Muskel zu decken. Legen Gericht auf Schüttler gesetzt bei Drehzahl 2 oder 3 für 20 Minuten. Soweit nicht anders vermerkt, sollte das Gericht auf einem Schüttler für die folgenden Schritte gesetzt werden.
3. Discard 4% PFA und waschen den Muskel mit 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils.
4. Discard letzten 1X PBS waschen und fügen 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS-Lösung für 30 '.
5. Discard 0,1 M Glycin-Lösung eined add 1X PBS mit Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin bei einer Konzentration von 1:200 für 15 '.
6. Discard α-Bungarotoxin Lösung und waschen Muskel in 1X PBS, 3 mal 10 'jeweils.
7. Permeabilisieren Gewebe, indem vorgekühlt Methanol und die Schale in der -20 ° C Gefrierschrank für genau 5 Minuten, kein Schütteln erforderlich.
8. Entfernen Methanol und 3 x waschen 10 'jeweils mit 1X PBS. Discard letzten Wasch-und Block-Gewebe mit 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS für 1 Stunde. Das Waschen und Blockierung Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
9. Inkubieren Sie die Muskeln über Nacht, Zittern, bei 4 ° C in einer Mischung aus Primär-Antikörper in Blocking-Lösung (vgl. Tabelle) verdünnt.

4. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 2

1. Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils bei Raumtemperatur.
2. Add-Cocktail Sekundärantikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (vgl. Tabelle). Die Muskeln müssen vor Licht von diesem Schritt weiter geschützt werden Foto-Bleiche von Alexa-Fluor 647-Fluoreszenz zu verhindern.
3. Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils.
4. Reinigen Sie verbleibende Bindegewebe in 1X PBS, schneiden Sie die seitlichen Grenzen der LAL Muskeln und Montage auf Folien Dorsalseite auf, die Verwendung von Glas Deckgläschen und Montage Medien. Verwenden Sie klare Nagellack Deckglas fixieren.
5. Schützen Sie Folien aus Licht und bei -20 ° C bis zur Analyse bereit.

5. Konfokale Bildgebung von LAL NMJs

1. Hochauflösende konfokale Bilder sind mit einem Leica Plan Apo 63X Öl-Objektiv (1.4NA) auf einem Leica TCS 4D konfokalen Mikroskop erreicht.
2. Fluorescein und Alexa 647-Signale wurden gleichzeitig mit Laserlinien 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) und 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) gescannt bzw.. Sequenziell ist Rhodamine Signal wird dann mit der Laserlinie 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) gescannt. Optische Schnitte wurden mit 0,3 &mgr; Abständen gesammelt, und die Anzahl der Bilder in der z-Ebene von 60 bis 80 variiert. Die Lochkamera ist Airy 1 (107,97 um) angepasst. Das Bildformat 1024 x 1024 (X, Y), mit einem Zoom-Faktor von 1, bei 400Hz Geschwindigkeit führt zu einer Bildgröße von 234,32 um x 234,32 um und Pixelgröße von 229,05 nm x 229,05 nm.
3. Leica TCS-NT Software zur Erfassung wird dann verwendet, um z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren.
4. Multipanel Bilder sind für Helligkeit und Kontrast mit Hilfe von Adobe Photoshop angepasst.
5. Für eine typische LAL Muskel, sollte man in der Lage sein ca. 75-100 en face NMJs analysieren. Synaptic Stabilität wird durch Merkmale wie räumliche Ausrichtung der prä-, peri-und postsynaptischen Elementen (zB Nerven, Schwann-Zellen und Muskeln), und Messungen der synaptischen Bereich (dh Synapse Größe) bestimmt.

Repräsentative Ergebnisse:

Bei den erwachsenen Säugetieren NMJ, erarbeitet ein einziger Motor Axon feinen Verästelungen, die sehr differenzierte Lauben einer Nervenendigung (Abb. 2; Green) Form auf einer einzigen Muskelfaser, die genau auf postsynaptische Cluster von Nikotinsäure AChRs (Abb. 2; Red) apposed . Perisynaptically, Terminal Schwann-Zellen eng decken alle Zweige der präsynaptischen Nervenendigungen (Abb. 2, blau). Die strukturelle und funktionelle Integrität dieses dreigliedrige Organisation ist stark gestört durch die tägliche Anwendung von Subtyp-spezifischen mAChR Inhibitoren. In dem hier vorgestellten Beispiel (Abb. 3), beschwört 4-DAMP, ein mAChR-Antagonist mit hoher Affinität für M1, M3, M4 und M5 mAChR-Subtypen, selektive Eliminierung von Nervenendigungen aus zahlreichen NMJs ganzen Muskel Oberfläche (Abb. 3B, C). Darüber hinaus sind Terminal Schwann-Zellen ungewöhnlich ruhig ⁸ als von hellen S100 Kennzeichnung ohne Prozess-Erweiterung (Abb. 3B ", 3C") belegt. Postsynaptisch sind Muskelfasern normal und es gibt keinen Verlust von nAChRs (Abb. 3B ', 3C).

Abbildung 1. Anatomische Lage und Organisation des LAL Muskel. Lage von rostral (rLAL), caudal (ClaI) und der LAL Nerv (LALn) und entsprechende Endplatte Bands gezeigt werden (A, Einschub). Die Lage und Orientierung der Nadel in Bezug auf die LAL Muskel ist für das Injektionsverfahren (B) dargestellt. Incision Punkte sind für die Dissektion Verfahren (C) gezeigt.

Abbildung 2. Tripartite Organisation der NMJ. High-Vergrößerung konfokalen Ansichten einer Maus NMJ. Ein einzelnes Axon erarbeitet feinen Endäste (A), dicht von Terminal Schwann-Zellen und deren Prozesse (A ', Sternchen zeigen Sie auf Terminaldienste Schwann Zellkörper) abgedeckt. Postsynaptisch in einer Muskelfaser, ist eine Ansammlung von Nikotinsäure AChRs genau auf die Zweige des Nervus Terminals apposedSignale und Terminal-Schwann-Zellen.

Abbildung 3. LAL Muskeln mit 4-DAMP, ein mAChR-Antagonisten behandelt werden. Low-und High-Vergrößerung konfokalen Blick LAL Muskeln mit Fahrzeug oder 4-DAMP behandelt. Im Gegensatz zu den Vehikel-behandelten Muskeln (A-A'''), zahlreichen NMJs in der 4-DAMP-behandelte Muskel fehlt Nervenendigungen (B-B''', C-C'''). Ein boxed Bereich in Abbildung 2B ist in Abbildung 2C gezoomt.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von bisher nicht Rollen von Subtyp-spezifischen mAChR Signalisierung in die Stabilität und die Wartung von Säugetieren NMJs. Diese Methode wird auch nützlich sein, um die Auswirkungen von neurotrophen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Zum Beispiel fand unser Labor, dass Ciliary neurotrophen Faktor (CNTF) sprießen aus nahezu allen LAL Nervenendigungen in erwachsenen Mäusen hervorgerufen 1 . Dieses Ergebnis mit früheren Studien von CNTF-behandelten Hinterbein Muskeln, die moderate berichtet sprießen bei ca. kontrastiert. 13-33% der gluteus und bei 9% der lateralen Gastrocnemius junctions ^3. Wir glauben, dass die Diskrepanz wurde durch eine gleichmäßigere und längere Exposition der Nervenendigungen zu CNTF in LAL als im Hinterbein Muskeln. In der Tat, wenn wir CNTF angewendet seitlichen gastrocnemius und tibialis anterior mit dem gleichen Protokoll, das weit verbreitete sprießen aus nahezu allen LAL NMJs hervorgerufen, beobachteten wir schwach sprießen aus nur eine bescheidene Anzahl von NMJs, die bevorzugt in der Nähe der Injektionsstelle befand. Offenbar hatte Exposition der Hinterlauf NMJs zu CNTF wurden begrenzte und uneinheitliche, als auch in einer früheren Studie festgestellt 2 . Auf der anderen Seite, CNTF zwischen dem subkutanen Bindegewebe und die LAL Faszie injiziert, aber nicht CNTF subkutan in Hinterbein Muskeln injiziert, bildeten eine lokale, subdermal Schwellung, die für mindestens eine Stunde vor dem vaskulären Resorption blieb. Bemerkenswert ist auch, dass selbst wenn die Injektion Frequenz CNFT oder mAChR Antagonisten wurde bis zu viermal täglich erhöht, haben wir nicht beobachten, besonders additive Wirkung von CNTF und mAChR-Antagonisten. Darüber hinaus, wenn die Injektion entsprechend durchgeführt wird, ist es unwahrscheinlich, dass eine direkte Schädigung der Muskulatur auftreten würden. Allerdings, wenn man es zu Schäden am Muskel während der Injektion, axonale Sprossung an der Nervenendigung oder an den Knoten, und / oder Muskelfaser Degeneration konnte ^1,8 beobachtet werden. Zusammenfassend sind LAL Muskeln ein einzigartiges Präparat, das einheitliche, bei längerer Exposition aller NMJs ermöglicht innerhalb eines Muskels mit relativ einfachen und schnellen Verfahren.

Je enger kaudalen Teil eines LAL Muskel ist dicker (3-5 Muskelfasern dicker) als die breiteren rostralen Teil (2-3 Muskelfaser dick). Dementsprechend sind NMJs mit Muskelfasern tief in caudal LAL positioniert verbundenen oft entweder gar nicht in wholemount Immunfärbung oder markierte nur von α-Bungarotoxin, die tiefer eindringt als Antikörper aufgrund ihrer geringeren Größe und eine hohe Affinität für nAChRs. Diese NMJs kann als verloren Nervenendigungen oder Schwann-Zellen durch spezifische Wirkungen der eingesetzten Medikamente falsch interpretiert werden. Es ist daher wichtig zu beachten, ob diese Verbindungen nur in caudal LAL beobachtet, und ob die NMJs oder Muskelfasern oberflächlich oder tief positioniert sind: oberflächlich positioniert Muskelfasern sind in der Regel mit deutlich höheren Hintergrund Immunfluoreszenz als tief positionierten Fasern verbunden sind. Alternativ kann man tief positioniert NMJs in der kaudalen Streifen des LAL aus wholemount Analyse verzichtet werden.

Obwohl vollständige Durchtrennung des LAL Nerven ist relativ einfach und erlaubt es uns, die Auswirkungen der mAChR Hemmung auf denervierten Muskeln Studie, die Größe und Zugänglichkeit der LAL Nerven der Arten von chirurgischen Ansätze, die untersucht werden können. Zum Beispiel, teilweise beschädigt LAL Nerven, um partielle Denervierung eines LAL Muskel bewegen scheint technisch sehr anspruchsvoll.