JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium

1, 1

1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 23.22.217.122, User IP: 23.22.217.122, User IP Hex: 387373434

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

    Date Published: 9/20/2011, Issue 55; doi: 10.3791/3128

    Cite this Article

    Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128, doi:10.3791/3128 (2011).

    Abstract

    התאים האיקריוטים רבים ניתן לזהות הדרגתיים של אותות כימיים בסביבה שלהם ולהעביר בהתאם 1. הגירה זו תא מודרך הוא כאמור chemotaxis, שהוא חיוני עבור תאים שונים כדי לבצע את תפקידם כגון סחר של תאים חיסוניים דפוסים של תאים עצביים 2, 3. משפחה גדולה של חלבון ה-G-מצמידים קולטנים (GPCRs) מזהה פפטידים קטנים משתנה, המכונה chemokines, לכוון את נדידת תאים in vivo 4. המטרה הסופית של chemotaxis המחקר היא להבין כיצד החושים מכונות GPCR chemokine הדרגתיים בקרות אירועים איתות המובילים chemotaxis. לשם כך אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לפקח, בזמן אמת, ריכוזי spatiotemporal התנועה, chemoattractants תא שיפוע של chemoattractant, בתיווך GPCR הפעלה של חלבון ה-G-heterotrimeric, ואירועים איתות תאיים המעורבים chemotaxis של התאים האיקריוטים 5-8 . האורגניזם אוקריוטים פשוטה, discoideum Dictyostelium, מציג התנהגויות chemotaxic הדומים לאלה של לויקוציטים, וד ' discoideum היא מערכת מודל מפתח לחקר chemotaxis האיקריוטים. כפי חופשית חיים אמבות, ד תאים discoideum לחלק במדיום עשיר. עם רעב, תאים להזין תוכנית התפתחותית שבה הם מצטברים דרך המחנה בתיווך chemotaxis כדי ליצור מבנים multicullular. רכיבים רבים מעורבים chemotaxis למחנה זוהו ד discoideum. הכריכה של המחנה GPCR (cAR1) גורמת ניתוק של heterotrimeric G-חלבונים לתוך Gγ ואת יחידות משנה Gβγ 7, 9, 10. יחידות משנה Gβγ להפעיל ראס, אשר בתורו מפעיל PI3K, המרת PIP 2 לתוך PIP 3 על קרום התא 11-13. PIP 3 לשמש אתרי קישור החלבונים עם הומולוגיה pleckstrin (PH) תחומים, ובכך לגייס אלו חלבונים בקרום 14, 15. ההפעלה של רצפטורים cAR1 שולט גם עמותות הממברנה של PTEN, אשר dephosphorylates PIP PIP 2 ל 3 16, 17. מנגנונים מולקולריים הם באבולוציה ב chemotaxis chemokine GPCR בתיווך של תאים אנושיים כגון נויטרופילים 18. אנו מציגים מהשיטות הבאות לחקר chemotaxis ד discoideum תאים. 1. הכנת התאים המרכיבים chemotactic 2. Chemotaxis הדמיה של תאים מפל cAMP. 3. ניטור הפעלת GPCR המושרה של heterotrimeric G-חלבון בתאים חיים אחת. 4. הדמיה chemoattractant-PIP מופעלות דינמי 3 תגובות בתאים חיים יחיד בזמן אמת. שיטות שפותחו שלנו הדמיה ניתן ליישם מחקר chemotaxis של לויקוציטים אנושיים.

    Protocol

    1. הכנת התאים המוסמכת chemotactic של discoideum Dictyostelium

    1. כדי לייצר תאים ד discoideum כי הם chemotactic למחנה chemoattractant, תאים הקציר הגוברת D3-T מדיה עשירה מתרבות רועד ב 22 ° C.
    2. לשטוף את התאים פעמיים חיץ שאינו מזין התפתחותי (חיץ DB המכיל 5 mM Na 2 HPO 4, 5 מ"מ KH 2 PO 4, 2 מ"מ MgCl 2, 0.1 מ"מ CaCl 2).
    3. Re-להשעות תאים חיץ DB בצפיפות של 2x10 7 תאים / מ"ל.
    4. Shake 10 תאים מ"ל בבקבוק 250 מ"ל ב 100 סל"ד ב 22 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
    5. ספק 100 μl של המניה 7.5 מיקרומטר cAMP ל 10 תאים מ"ל כל שש דקות מעל 6 שעות כדי להשיג הריכוז הסופי של מחנה 75 ננומטר, תהליך המיועד לטיפול cAMP פועם. לאחר 5-6 שעות של טיפול cAMP פועם, ד תאים discoideum להיות chemotactic המוסמכת שיפוע לכיוון המחנה.
    6. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות ואז התאים resuspend עם חיץ DB המכיל קפאין 2.5 מ"מ, וללחוץ על 200 סל"ד ב 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי basolate התא למצב chemotactic.

    2. הדמיה chemotaxing תאים צבע chemoattractant גלוי למניפולציה

    1. למילוי micropipette עם פתרון מוכן טרי 30 μl של מחנה 1 מיקרומטר ו אלקסה 594 ב 0.1μg/μl במאגר DB.
    2. צרף את Femtotip לבעל micropipette ולחבר את צינורות אל מנגנון אספקת הלחץ, מערכת Eppendorf FemtoJet.
    3. צרף את הרכבה micropipette כדי micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) ממונע micromanipulator לתת לחץ קבוע על מנת ליצור שיפוע יציב.
    4. הר תא אחד טוב LabTek מלא 6 מ"ל של חיץ DB על העדשה שמן 40X על מיקרוסקופ confocal ולהשתמש בהיר בתחום האופטיקה, במרכז Femtotip לשדה הראייה.
    5. הפעל את אספקת הלחץ ולהגדיר את הלחץ פיצוי (PC) עבור 70 hPa להקים שיפוע של התערובת 594 cAMP / Alexa.
    6. דמיינו מפל cAMP על ידי ניטור תערובת של הריכוז הרצוי של המחנה אלקסה 594 הקרינה באמצעות עירור עם קו 543 ננומטר לייזר.
    7. שימוש אוטומטי מיצוב תפקידו של micromanipulator לשים micropipette לעמדות הרצוי ולהגדיר אותם 1 מיקום, מיקום 2, ומיקום 3 לתפעל את שיפוע אשר תא חשופים.

    3. תא נייח מערכת nonpolarized מקלה אירועים הדמיה איתות מעורבים במחנה שיפוע חישה

    1. לאחר הטיפול בקפאין, להסיר aliquot של תאים צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 3 דקות.
    2. הסר חוצץ ו לדלל התאים 5x10 5 תאים / מ"ל עם חיץ DB טרי המכיל קפאין 2.5 מ"מ.
    3. החל 1 מ"ל של השעיה תא לתא בודד טוב או 0.4 מ"ל היטב בכל תא ארבעה באר.
    4. אפשר לדבוק תאים עבור 10 דקות, בזהירות פיפטה את החיץ להסיר תאים פנויים ולהחליף עם נפח זהה.
    5. אתר את התאים תחת מיקרוסקופ הרצוי ולהתחיל הדמיה.
    6. לצורך ניסוי שנועד לפקח על הדינמיקה של איתות רכיבים בתאים לחשוף את שיפוע יציב, לטיפול בתאים עם 5.0 מיקרומטר (הריכוז הסופי) Latrunculin ב 10 דקות לפני הניסויים.

    4. ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP 3 הייצור

    1. cAMP פועם לפתח תאים שיתוף להביע GαCFP ו YFPGβ (תאים G) ותאי להביע PIP 3 אינדיקטור PH-GFP (תאים PH) 7.
    2. מערבבים את שני סוגי תאים עם יחס 1:1 ו צלחת אותם לתאי אחד טוב או 4-היטב.
    3. צור ושמור את טביעת האצבע פליטת התייחסות עקומת CFP, YFP ו-GFP באמצעות רכישת Lambda מצב סטאק בטווח הספקטרום מ 464 ל 624 ננומטר עם רוחב של 10 ננומטר.
    4. במקביל תמונה חלבון G הפעלה בתאים G ו-3-PIP ייצור תאים עם PH באמצעות רכישת אותו במצב Lambda סטאק בטווח הספקטרום 464-544 ננומטר עם 10 ננומטר במרווחים.
    5. החל לתפקד unmixing שכבות של תוכנת 510META Zeiss באמצעות הציל CFPand YFP ואת טביעות אצבעות פליטת מתמטית כדי לחשב את התרומה של כל fluorophore בערימה Lambda להפריד את CFP ועוצמת YFP לאפיקים בודדים G.
    6. עם אסטרטגיה דומה, להחיל unmixing פונקציה לינארית באמצעות GFP ניצלו פליטה טביעות אצבעות רקע מתמטי לחישוב עוצמת ה-GFP בתאים PH.

    5. נציג התוצאות:

    1. מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. אמבה חברתיים, ד discoideum תערוכות chemotaxis בולט במהלך מחזור החיים. בשל יתרונות גנטיים ביוכימיים שלה, ד ד מספק של עוצמהystem ללמוד chemotaxis.
    2. Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. הנה, אנחנו הראשונים להראות מתודולוגיה פשוטה כדי להשיג קשר לינארי בין מחנה הריכוז לבין עוצמת צבע פלואורסצנטי אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ"ל Alexa 594 (איור 2 א). הבא, אנחנו מספקים דרך קלה כדי להמחיש את שיפוע יתר על כן, להקים מדידה כמותית למחנה הריכוז של צבע מעוצמת Alexa 594 (איור איור. 2B).
    3. תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. מעכב פילמור אקטין מבטלת קיימים הקוטביות מורפולוגיים גם מונע תנועת התא תוך שמירה על יכולת של התאים של חישה כיוונית (איור 3A). התעסוקה של גירוי cAMP גלוי למניפולציה ערבויות קלט, למשל גירויים אחיד או שיפוע. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של חלוקה מחדש cAMP-Induced של רכיבים איתות מפתח במנגנון שיפוע חישה. הדינמיקה spatiotemporal מדודים של רכיבים אלה איתות מאפשרים לנו להבין כיצד רשת איתות משיגה הסתגלות גירויים אחיד תוך יצירת תגובות ביוכימיות מקוטב אל הדרגתיים (איור 3B).
    4. מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. זה קריטי על מנת למדוד את הדינמיקה / קינטיקה של כיוונית חישה איתות רכיבים להבין איך כל מרכיב תורם להקמת קיטוב תאיים, כאשר התאים חווים שיפוע הראשון. יישום של הדמיה תא חי עם החלטה הקצב מרחבית גבוהה, אנחנו הראשונים מראים ייצור biphasic PIP3 של התא שבו הוא נחשף מפל cAMP יציב (איור 4A-C). יישום הדמיה תא חי, יש לנו למדוד באופן שיטתי את הדינמיקה של כיוונית חישה רשת איתות ספציפיים גירוי cAMP לייצור PIP3 (איור 4D, E).
    5. ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP 3 הייצור על גירוי cAMP אחיד. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (מקוצר סריג) מספק גישה יעילה לעקוב heterotrimeric הפעלת חלבון G (דיסוציאציה) על גירוי המחנה. כאן, אנו תיאר מערכת נוח וקל לאמץ מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric 3 הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP 3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה (איור 5 ). גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G בעוד מתמשך אשר מעורר ייצור חולף 3 PIP.

    איור 1
    איור 1: מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. א Scheme מציגה מסלול איתות קצר של חישה כיוונית. שיפוע ב cAMP גורם chemotaxis המהירה של ד discoideum תאים. תאים להביע 3 PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. בר סולם = 50μm.

    איור 2
    איור 2: Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. גרף א 'מציג מערכת יחסים בין ליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ"ל אלקסה 594. מדידה כמותית ב למחנה הריכוז של צבע על ידי הקשר הליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 א '

    איור 3
    איור 3: תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. תמונה א 'מראה כי התאים ללא תנועה על ידי טיפול של פילמור אקטין מעכב Latrunculin B לשמור על יכולת חישה של כיווניות. תאים להביע 3 PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. B. למניפולציה גירויים תנועה cAMP מערכת התא מאפשר לענות על שאלות המפתח של חישה כיוונית. בר סולם = 10μm.

    איור 4
    איור 4: מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. א מונטאז' מראה PIP biphasic 3 הייצור (ירוק) של התא, אשר נחשף מפל cAMP יציב (אדום). B. תמונה המציגה את האזורים של אינטרסים (ROIs) למדידת קינטיקה של ייצור PIP 3 הציג ב C. C . קינטיקס oו 3 ​​PIP ייצור התאים נחשפים שיפוע קבוע. ד Scheme מראה את רשת איתות של חישה כיוונית מן גירוי cAMP לייצור PIP 3. קינטיקה שלהם בחשיפה שיפוע קבוע מוצג הקווים באותו צבע מוצק E.

    איור 5
    איור 5: ניטור סימולטני רב אירועים של רשתות איתות GPCR. תוכנית א 'מראה מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric 3 הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה. מונטאז' של תמונות ב קשת של G ו-PH מראה תאים כי גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G מתמשך על התא הפריפריה, בעוד אשר מעורר ייצור חולף PIP3. נקודות הזמן הן לפני (0s) ואחרי גירוי עבור 4.9s, 10.2s ו 20.4s. ג קינטיקה של הפעלת חלבון G ו PIP3 הייצור על גירוי מחנה אחיד.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    תהליכי להגיע לשלב המוסמכת chemotactic של תאים

    עבור סוג ד בר תאים discoideum, זה לוקח בערך 5 ~ 6 שעות פועם פיתוח בטמפרטורת החדר כדי לגרום להם לשלב היטב chemotactic מוסמך שבמהלכו התאים להציג מורפולוגיה הסלולר מקוטב היטב נדידת תאים מהיר (איור 1). מספר גורמים, כמו מחנה ריכוז פועם, טמפרטורה, רקע גנטי שונה, עשוי להשפיע על תהליך ההגעה לשלב המוסמכת chemotactic. שיפוע מדריכים cAMP התאים לנוע לעבר מקור של המחנה, נדידת תאים ביים כאזור chemotaxis. עם זאת, תאים שלא הגיעו לשלב המוסמכת chemotactic עקב התפתחות לא מספקת או הרקע הגנטי שלהם לא יכול להראות שתי תכונות אופייניות: מורפולוגיה מקוטב ותנועה תאים מהירה. מצד שני, תאים שעברו את השלב המוסמכת chemotactic בגלל התפתחות יתר לעיתים קרובות בצורה גושים של התאים, אשר קשה מאוד להפריד לתוך תאים בודדים עבור ניסויים הדמיה ..

    1. הדמיה chemotaxing תאים צבע chemoattractant גלוי למניפולציה

    זהו מראש טכנית ליישם גירוי chemoattractant שכותרתו fluorescently ו למניפולציה לתוך מערכת ניסיונית. מבחינה היסטורית, היו לנו ליישם או גירוי להחיל homogenously (המכונה גם גירוי אחיד) או גירוי שיפוע לצפות מורפולוגיה תא והתנהגויות. עם זאת, גירוי "עיוורת" לא מראה שום מידע הקצב מרחבית על איך גירויים מגיע לתאים, ולכן מטיל ספק על כל התצפיות "נורמלי" של תגובות התא. כאן, אנו מראים יישום של צבע פלואורסצנטי (Alexa594, בדיקה מולקולרית) עם chemoattractant ליצור מערכת יחסים ליניארי בין ריכוז chemoattractant ועוצמת יום פלורסנט פיקוח (איור 2 א, ב). שילוב רכישה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו פליטת אדום של צבע פלואורסצנטי (Alexa594) אשר מאפשר לנו לפקח גם גירויים ותגובות התא על גירוי זה (איור 2C).

    על פי דרישת הניסוי, יש שילובים יותר זמין. בעוד בהתחשב צבע פלואורסצנטי חדש, חשוב לאשר פלורסנט מתאימה עבור הניסוי שלך, במיוחד עבור הניסוי שיפוע, חשוב לאשר את דיפוזיה שיתוף יעילות של גירויים שלך צבע פלואורסצנטי. כמו כן, על מנת לקבל יחס לינארי של ריכוז גירויים ועוצמת צבע ניאון מעורבת, יש צורך לרכוש את הריכוז המרבי של גירויים ללא הרוויה של אינטנסיביות.

    2. תא נייח מערכת nonpolarized מאפשר הדמיה תא חי

    Chemotaxis היא תהליך מסובך הסלולר, אולם זה יכול להיות גזור לשלושה היבטים בסיסיים: קיטוב תנועתיות הסלולר, חישה כיוונית. מורפולוגית, הקיטוב של נקרא מול מובילה ברורים ולסיים נגרר של תא. רכיבים איתות רבים מעורבים chemotaxis להתמקם fornt או בחזרה תאים מקוטב. כיוונית חישה היא היכולת של תא לתרגם הדרגתי לתוך תאי מקוטב קיטוב ביוכימי תאיים. כפי שמוצג באיור. 3A, הטיפול של תאים עם פילמור אקטין מעכב (Latrunculin B) במהירות מבטל תנועתיות התא ואת הקיטוב המקורי. באופן מפתיע, התאים עדיין יכולים להקים קיטוב תאיים, כגון הצטברות של PIP 3 בחלק הקדמי של התאים מול שיפוע (כפי שמוצג על ידי סהר PIP3biosensor, PH-GFP), המעידים כי חישה כיוונית של התאים יכולים להיות מנותקים קיטוב התא תנועתיות התא. מערכת זו לא מקוטב התא מאפשר לנו לקבוע את הקינטיקה של איתות רכיבים חיוניים chemosensing ללא סיבוך של תנועתיות התא ואת הקיטוב הקודם. בעד ונגד, טיפול מעכב פילמור אקטין מבטל את כל הדינמיקה התלויים על cytoskeleton-אקטין.

    3. ניטור הרשת על ידי הדמיה איתות רב ספקטרלי תא חי

    אירוסין של המחנה לקולטן שלו מעוררת הפעלה של חלבון G heterotrimeric. בתור לאחר מכן, Gβγ מנתק למקטע מתוך למקטע Gα ומפעיל effectors הזרם כדי לעורר תגובות התא כגון ייצור PIP3. ההתקדמות הטכנית על קצב ברזולוציה מרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאפשר הדמיה בו זמנית של מספר אירועים איתות ברמה subcellular בתאים חיים. בסעיף זה, אנחנו הראשונים מראים הדמיה סימולטני של שתי מולקולות איתות יחד עם שיפוע ניטור cAMP (איור 4 א). בשלב הבא, אנו מציגים דימות ספקטרלי של הפעלת G ותגובה במורד תא הייצור שלה PIP3 (איור 4 ב). פורסטרתהודה העברת אנרגיה (מקוצר סריג), הידוע גם העברת אנרגיה פלואורסצנטי תהודה, תהודה העברת אנרגיה (מיל) או העברת אנרגיה אלקטרונית (EET), הוא מנגנון המתאר העברת אנרגיה בין שתי chromophores. ישנם שלושה קריטריונים המופע של סריג: חפיפה של פליטת התורם עירור acceptor, אוריינטציה המתאים, מרחק קצר (<10 ננומטר). הדרישה מרחק / הכיוון של שתי מולקולות מקלה סריג להיות דרך יעילה לזהות חלבונים אינטראקציה או לשנות intromolecular הקונפורמציה של חלבון. הנה, השתמשנו הנפוצות CFP / YFP סריג זוג (Gα-CFP/Gβ-YFP) כדי לפקח על ניתוק דינמי של חלבון G α / βγ יחידות משנה בתאים חיים. בתור עיצוב ניסיוני חכם שתיארנו כאן הוא לערבב שני סוגים שונים של תאים על מנת לפקח בו זמנית הן הפעלת חלבון G ו PIP3 ייצור כשזה לא נוח למדוד את כל הדינמיקה בתא אחד.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין ניגודי אינטרסים הכריז.

    Acknowledgements

    עבודה זו נתמכת על ידי קרן עירונית מ NIAID, NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D3-T Growth Media KD Medical
    Caffeine Sigma-Aldrich
    Latrunculin B Molecular Probes, Life Technologies
    Alexa 594 Molecular Probes, Life Technologies
    cAMP Sigma-Aldrich
    ChronTrol XT programmable timer ChronTrol Corp
    Miniplus 3 peristaltic pump Gilbson
    Platform rotary shaker
    FemtoJet microcapillary pressure supply Eppendorf
    Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc international
    LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope Carl Zeiss, Inc. a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens
    Olympus X81 or equivalent Olympus Corporation Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens

    References

    1. Lijima, M., Huang,Y.E., & Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469 (2002).
    2. Murphy, P.M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593 (1994).
    3. Devreotes, P.N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235 (1994).
    4. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1 (2008).
    5. Meier-Schellersheim, M., et al. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82 (2006).
    6. Xu, X., et al. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, ra71 (2010).
    7. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L.E., & Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, 676 (2005).
    8. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., & Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141 (2007).
    9. Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C.A., & Devreotes, P.N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034 (2000).
    10. Janetopoulos, C., Jin, T., & Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408 (2001).
    11. Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., & Firtel, R.A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795 (2001).
    12. Li, Z. et al. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046 (2000).
    13. Sasaki, A.T., Chun, C., Takeda, K., & Firtel, R.A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505 (2004).
    14. Meili, R. et al. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092 (1999).
    15. Parent, C.A. Blacklock, B.J. Froehlich, W.M., Murphy, D.B., & Devreotes, P.N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81 (1998).
    16. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., & Firtel, R.A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611 (2002).
    17. Iijima, M. & Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599 (2002).
    18. Van Haastert, P.J. & Devreotes, P.N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626 (2004).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter