El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

1. Preparación Experimental generales

1. Preparar el medio de cultivo de tejidos en la campana de flujo laminar.
   1. Diluir medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) (1 botella de L con 4,5 g / l de glucosa, bicarbonato de sodio, y L-glutamina). Añadir 10 ml de penicilina / estreptomicina / antibióticos neomicina.
   2. Tomar 100 ml de DMEM con una pipeta de transferencia estéril y reemplazar con 100 ml de suero de pollo.
   3. Alícuota del DMEM/10% de pollo suero / 1% de los antibióticos en 15 viales estériles ml y congelar.
2. Preparar tampón fosfato salino (PBS) suplementado con calcio y magnesio. Mezclar 100 ml de PBS 10X, 900 ml de agua desionizada, y 1 ml de una solución concentrada de calcio y magnesio (100 mg / mL de CaCl ₂ • 2H ₂ O, 100mg/ml de MgCl ₂ • 6H ₂ O).
3. Incubar los huevos en una orientación longitudinal a la etapa deseada según la definición de Hamburger y Hamilton ¹ (es decir 23 a 25 horas para la etapa HH 5, o 42-48 Horas para las etapas HH 11-12).
4. Eliminar los embriones de los huevos con el método del papel soporte del filtro.
   1. Romper la parte inferior del huevo en el lado de la A150 mm placa de Petri. Separar la cáscara de la parte inferior y vaciar el contenido del huevo en el plato.
   2. Retire la más gruesa, viscosa albúmina del huevo con unas pinzas romas.
   3. Cortar círculos de Whatman # 2 el papel de filtro 2-3 cm. de diámetro. El uso de un solo taladro, agujeros en el centro del papel de filtro. Coloque uno de los anillos de papel de filtro en la yema de un modo que mantiene el embrión visible a través del agujero central en el ring.
   4. Corte alrededor del diámetro exterior del papel de filtro con micro tijeras. Retire el papel de la yema de huevo con unas pinzas finas.
   5. Enjuague suavemente el embrión en PBS para eliminar las partículas adheridas yema de huevo. (HH5 embriones puede necesitar para disfrutar el tiempo de 15-20 minutos para eliminar la yema residual). Retire el conjunto del filtro de papel del baño y se coloca con la parte ventral en un35 mm placa de cultivo. Coloque un segundo anillo de papel de filtro encima de la primera, intercalando el embrión entre los anillos. Poner un anillo de metal alrededor de la parte exterior del sándwich de papel de filtro (≈ 1,5 a 2 cm de diámetro) para obtener el embrión.
   6. Sumerja el embrión en el medio de cultivo. Verificar la morfología adecuada y la etapa embrionaria con un microscopio de campo claro.
5. Use un extractor de pipeta para preparar finas agujas de vidrio punta (1,5 mm de diámetro interior) (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota FL) para las disecciones de tejidos posterior y el etiquetado.

2. DII Etiquetado de HH Etapa 5 embriones con partículas de hierro magnético

1. Añadir unas gotas de DII saturadas en alcohol a una pequeña cantidad de polvo de hierro (hierro reducido, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey) a temperatura ambiente y dejar secar. (Esto generalmente hace que las partículas de pastel juntos una vez que el alcohol se haya evaporado.) Use la punta de una micropipeta tiró para romper las partículas de hierro agrupada,transferirlos a un tubo de microcentrífuga, y enjuague varias veces y cubrir con agua desionizada.
2. Para etiquetar las células ectodérmicas en una etapa de HH 5 embrión, el embrión lugar cosechada (es decir, todo el conjunto de papel de filtro) dorso en una placa de cultivo de 35 mm cubierto con una capa generosa de medios de cultivo y poner el plato bajo un microscopio de disección. Use una aguja de vidrio para eliminar la membrana vitelina y exponer a las células ectodérmicas. (Tenga cuidado de no perforar embrión).
3. Dibuja una columna de partículas de hierro marcado (en agua desionizada) en una pipeta de Pasteur. Usando el microscopio de disección, sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido y la posición justo por encima del embrión. Al girar la pipeta lentamente hacia adelante y hacia atrás entre las yemas de los dedos, se empujan las partículas fuera de la pipiette y espolvorear todo el embrión.
4. Una vez que el embrión está cubierto de partículas, que lo coloque en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 10 minutos. Tome embrión de la incubadora unad uso de un potente imán para eliminar las partículas.
5. Utilizar un microscopio de fluorescencia con cámara de vídeo conectada y adecuada configuración de los filtros para adquirir el campo claro y las imágenes fluorescentes del embrión, como se muestra en la Figura 2, B.
6. Tenga en cuenta la densidad de la etiqueta. Si una distribución más densa se desea, utilice partículas adicionales (como se describió anteriormente) para etiquetar el embrión una vez más y extender el tiempo de incubación en consecuencia. Si las etiquetas son demasiado densas, añadir una pequeña cantidad de partículas de hierro no-marcados con el tubo de microcentrífuga lleno de partículas ya etiquetados y mezclar el contenido del tubo. Repita el proceso de etiquetado con un nuevo embrión y una vez más en cuenta la densidad de la etiqueta.

3. Etiquetado de microesferas de poliestireno de tomografía de coherencia óptica (OCT) de imágenes de HH11-12 embriones

1. Prepare una solución de negro de 10 micras de diámetro microesferas (Polysciences Inc., Warrington, PA) en PBS en una placa de Petri de 35 mm. (Cuentas debe ser lo suficientemente grande como para generar contraste para octubreimagen, pero lo suficientemente pequeño tal que el tamaño de grano es del orden de las células individuales. Valores específicos pueden variar dependiendo de la resolución de su sistema de octubre y los tejidos en estudio). Una gota de la solución madre (2,6% de sólidos de látex) por ml de PBS es suficiente. Tire de esta solución en una jeringa de 10 cc con una aguja de calibre 22. Vortex la solución durante 30 segundos para asegurar una distribución uniforme de cuentas.
2. Bisel las puntas de las agujas de vidrio tirado con un disco duro del ordenador ^2. Diámetro de la punta debe ser lo suficientemente grande que las cuentas pueden tener acceso desde la apertura, pero al mismo tiempo, lo más pequeño posible para minimizar la herida de tejido durante la inyección.
3. Llene una aguja de cristal biselado con la solución de cuentas con la jeringa. Ligera película de la micropipeta para asegurarse de que la solución se ha llegado a la punta.
4. El uso de un micromanipulador, colocar la aguja de vidrio en el mismo campo de visión como el embrión. Cuentas debe ser que sale de la punta de la pipeta.
   1. Si no beads salir de la micropipeta, puede haber una obstrucción. En este caso, repita los pasos 3.2-3.4 con una aguja de vidrio nuevo.
   2. Si demasiados collares nublar tu campo de visión, la punta de la pipeta puede ser demasiado amplio. Repita los pasos 3.2 a 3.4 con una pipeta nueva y un nuevo embrión.
5. Inserte la punta de la pipeta en el lumen del tubo de cerebro. Asegúrese de no perforar el piso ventral del tejido. Usted verá una inflamación transitoria de los tejidos como los granos y líquidos entrar la luz. Esto indica una intubación exitosa, ahora, rápidamente saque la aguja de vidrio.
6. Verificar una densidad suficiente de cuentas en la luz interior del tubo del cerebro usando un microscopio de campo claro. Deje que las cuentas se conforme con 20 - 30 minutos antes de proceder a la secta. 4.

4. Adquisición de Datos

* Los siguientes métodos son adecuados para la técnica de fluorescencia de etiquetado se ha descrito anteriormente. Sin embargo, con la técnica de etiquetado de las microesferas, las cuentas se pueden desprender cuando la transferencia de muestrasentre las incubadoras y sistemas de imágenes. En este caso lo mejor es continuar con el paso 4.2 (lo que evita el movimiento de la muestra / agitación en total). En ambos métodos, los embriones son cultivados mientras está sumergido en un medio de cultivo líquido. Si el embrión no está completamente sumergida (como es el caso de algunas de las técnicas de cultivo convencionales de tejidos), la geometría del tejido está muy alterado debido a la deformación altas cargas de tensión superficial y la distribución de la tensión se logran captar con precisión lo normal en 3-D morfogénesis ^{3, 4.} Por otra parte, sumergiendo el tejido impide el contraste brillante observada en la interfase líquido-gas en octubre de imágenes de oscurecer la morfología embrionarias y las coordenadas del marcador.

1. Embrión de Cultura (general)
   1. Después de la adquisición de su primera imagen (campo claro, fluorescencia, o PTU), poner un máximo de siete placas de 35 mm de la cultura (los embriones) en un 150 mm placa de Petri y el lugar todo el conjunto en una pequeña bolsa de plástico. Añadir un par de gotas de agua desionizada a la bolsa para la humidificacióny llenar la bolsa con un 95% O ₂ / 5% mezcla de CO _2. Colocar los embriones en la incubadora a 37 ° C (cola Stabiletherm, Asheville, Carolina del Norte) durante el tiempo deseado hasta el siguiente punto de tiempo de imágenes. El uso de este método, los experimentos se pueden realizar en varios embriones en el mismo día.
2. Time-lapse cultura (automatizada)
   1. Coloque los embriones etiquetados en un plato de Delta T (35 mm de diámetro exterior, 23 mm de abertura central con pared lateral cónica, de vidrio grueso 0.17mm; Bioptechs, Butler, PA) que contiene 1,2 ml de medio de cultivo.
   2. Cubra el plato con una tapa de vidrio se mantuvo a 37 ° C con un Bioptechs Delta T4 controlador de placa de cultivo (para evitar la condensación). Superfuse el embrión con un 95% O ₂ / 5% CO ₂ mezcla de gas suministrado desde un dispositivo variable Mini-bomba (Fisher Scientific). Antes de alcanzar el embrión, calentar y humidificar el gas por burbujeo a través del agua desionizada en un ambiente cálido (<100 ° C) plato caliente. Un esquema de este s experimentalet-up se muestra en la Figura 1.
   3. Configurar el software para adquirir automáticamente las imágenes a intervalos de tiempo especificados por el usuario. Para nuestro microscopio de fluorescencia, se utiliza Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), y para nuestro sistema de octubre, se utiliza barrido fuente Thorlabs software (Newton, NJ). Debido a que este método es en la actualidad sólo capaz de manejar un lapso de tiempo en el experimento un tiempo, a menudo es mejor permitir que este tipo de culturas que durante la noche. Se podría sortear esta limitación mediante la instalación de un escenario automatizado traducible compatible con el hardware y el software del sistema de imagen ^5.

5. Los resultados representativos:

Las etiquetas se realiza un seguimiento de forma automática (mediante Volocity, PerkinElmer) o manualmente (con el plug-in Manual de seguimiento en ImageJ, NIH) en cada experimento. En la técnica de marcaje fluorescente, se utiliza la rutina de Matlab gridfit para adaptarse a las superficies de 2D a través de las coordenadas marcador, lo que permite cepas morfogenéticos superficie que se calcula ^{6, 7.} Ecuaciones estándar se utilizan para transformar estos valores en un sistema de coordenadas embrionarias correspondientes. Por otra parte, en la técnica de octubre, las superficies se generan a partir de los volúmenes de la imagen segmentada (obtenido a través de software estándar, como Matlab o Caret ⁸⁾ y las cepas se puede calcular en la dirección de curvatura máximo o mínimo de la muestra ^9.

Utilizamos nuestra técnica de partículas de hierro para marcar y seguir el movimiento de las células ectodérmicas durante la formación de la cabeza veces en el embrión de pollo temprano. Como se muestra en la Figura 2A, las células de la etiqueta fluorescente se distribuyeron en todo el embrión completo. Campo claro y las imágenes fluorescentes de los embriones fueron capturados en diferentes intervalos durante el cultivo in ovo ex. Los movimientos de las etiquetas de seguimiento (Fig. 2B, C) se utilizaron para calcular la distribución de la evolución de la tensión morfogenéticos durante la formación de cabeza doble (Fig. 2D-F).

Figura 1. Esquema de puesta a punto para el cultivo de tejidos de lapso de tiempo.

Figura 2. Cuantificación de 2-D deformaciones de tejido en el embrión de pollo temprano con un seguimiento etiquetas fluorescentes. (A) brillante combinados de campo / fluorescentes de imágenes de la etapa 5 HH de embriones después de la eliminación de partículas de hierro. DII-etiquetaed células ectodérmicas (rojo) se distribuyen en todo el embrión completo. (B, C) El movimiento de las células marcadas se siguió utilizando ImageJ. Desplazamientos etiqueta se calcularon las coordenadas de embriones (X, Y). Tenga en cuenta que A y B son la misma imagen. (DF) parcelas de contorno de la evolución de la distribución longitudinal tensión durante la formación de cabeza doble. Longitudinal cepas de Lagrange se calculan en relación con HH etapa 5 (es decir, A y B) después (D) 75 min, (E) 120 min, y (F) 165 minutos de incubación. Estas cepas caracterizan los cambios de longitud de los elementos de la línea originalmente orientado a lo largo del eje Y (en la etapa 5 del embrión). Más detalles sobre el uso de la etiqueta seguimiento de coordenadas para el cálculo de las cepas morfogenéticos se pueden encontrar en Filas et al. (2007) ⁶ y Varner et al. (2010) ^7. Tenga en cuenta que C y F son la misma imagen. Barra de escala = 500 micras.

Figura 3. Cuantificación de 3-D del tejido deformations en el cerebro de pollo temprano. (A) microesferas de poliestireno que se adhieren a la (flecha negro) dorsal y ventral (flecha blanca) lados del tubo del cerebro son fácilmente discernibles de los tejidos circundantes de puntos de vista transversal cruz section.Ventral reconstrucciones de octubre muestran la ubicación de las microesferas cerca de la frontera a mediados de rombencéfalo en (B) HH12 y después (C) 6 horas de incubación (M: mesencéfalo, H: cerebro posterior). Varios grupos de cuentas se resumen para destacar la deformación total del tejido. (D) longitudinal (E _zz) y circunferencial (E _θθ) de las cepas de Lagrange se calcula a partir de estas deformaciones. Cepas positivas y negativas circunferencia longitudinal en el límite de mediados de los hindbrain reflejan un alargamiento axial y acortamiento circunferencial de la región durante el cultivo. Más detalles sobre el cálculo de las cepas morfogenética de superficies complejas durante la morfogénesis se puede encontrar en Filas et al. (2008) ^9. Barra de escala = 200 micras.

Dos técnicas de etiquetado de los tejidos se presentan para el cultivo ex ovo de embriones de pollo temprano. El primero utiliza tintes fluorescentes lipofílicos entregado a través de partículas de hierro magnético para etiquetar simultáneamente cientos de células. Sin embargo, este método no es compatible con la tomografía de coherencia óptica, como los tintes fluorescentes en general, poco contraste de los tejidos circundantes con ^{10 de octubre.} Por lo tanto, se muestra una técnica alternativa con microesferas de poliestireno para etiquetar tejidos para time-lapse análisis de octubre Esta técnica produce conjuntos de datos en 3-D, pero se debe tener cuidado de no desplazar las cuentas de los tejidos. El uso de cualquiera de estos métodos en el entorno experimental adecuado debe ofrecer un etiquetado fiable del tejido y el desarrollo in ovo ex en los embriones tempranos. Ambos métodos usan fácilmente disponibles, de relativamente bajo costo de los materiales (por ejemplo, polvo de hierro, microesferas de poliestireno) y permiten la deformación del tejido a ser cuantificados durante la morfogénesis. Lamarcadores de tejido en ambos casos puede ser fácilmente reproducible y se aplica a los tejidos embrionarios y no requieren equipo especializado, por lo que estos experimentos accesible para los recién llegados en el campo. Visualizar y analizar los datos resultantes (por ejemplo, mapas de computación cepa morfogenética) debería ayudar a aclarar los mecanismos de la morfogénesis en el sistema modelo de ^{6, 7, 9, 11, 12.}