Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

1. Preparação Geral Experimental

1. Prepare o meio de cultura de tecidos na capela de fluxo laminar.
   1. Dilua Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) (1 garrafa de 4,5 g L com / L de glicose, bicarbonato de sódio, e L-glutamina). Adicionar 10 mL de penicilina / estreptomicina / neomicina antibióticos.
   2. Remova 100 mL de DMEM com uma pipeta de transferência estéril e substituir por 100 ml de soro pinto.
   3. Alíquota a garota DMEM/10% de soro / antibióticos de 1% em 15 mL estéreis frascos cônicos e congelar.
2. Prepare tampão fosfato salino (PBS), suplementado com cálcio e magnésio. Misturar 100 mL PBS 10X, 900 mL de água deionizada, e 1 mL de uma solução de cálcio e magnésio concentrado (100 mg / mL CaCl ₂ • 2H ₂ O, 100mg/ml MgCl ₂ • 6H ₂ O).
3. Incubar os ovos em uma orientação longitudinal para o estágio desejado, conforme definido pelo Hamburger e Hamilton ¹ (ie 23-25 ​​horas para HH estágio 5, ou 42-48 Horas para estágios HH 11-12).
4. Remover embriões do ovo usando o método transportadora filtro de papel.
   1. Rachar o fundo do ovo ao lado da placa de Petri A150 mm. Separar a casca do fundo e esvaziar o conteúdo do ovo no prato.
   2. Remova a mais espessa, viscosa do albúmen do ovo com a pinça romba.
   3. Cortar círculos de Whatman # 2 papel de filtro 2-3 cm. de diâmetro. Usando um único furo furos, soco no meio do papel de filtro. Coloque um dos anéis de papel de filtro sobre a gema de uma forma que mantém o embrião visível através do furo central no ringue.
   4. Corte em torno do diâmetro externo do papel de filtro com microtesoura. Remova o papel da gema com uma pinça fina.
   5. Lave o embrião em PBS para remover partículas gema aderente. (HH5 embriões pode precisar de molho enquanto 15-20 minutos para remover gema residual). Remova o conjunto do papel de filtro do banho e colocá-lo lado ventral em um35 placa de cultura mm. Coloque um anel de papel filtro no topo segundo o primeiro, imprensando o embrião entre os anéis. Colocar um anel de metal do lado de fora do sanduíche de papel de filtro (≈ 1,5-2 cm de diâmetro) para proteger o embrião.
   6. Submergir o embrião em meio de cultura. Verificar a morfologia adequada e estágio embrionário com um microscópio de campo claro.
5. Use um extrator da pipeta para preparar agulhas de ponta fina de vidro (1,5 mm de diâmetro interno) (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota FL) para dissecção do tecido subseqüentes e rotulagem.

2. DII Rotulagem de HH Stage 5 embriões utilizando partículas de ferro magnético

1. Adicione algumas gotas de DII saturada em álcool a uma pequena quantidade de pó de ferro (ferro reduzido, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) em temperatura ambiente e deixe secar. (Isso geralmente faz com que as partículas de bolo juntos uma vez que o álcool tenha evaporado.) Use a ponta de uma micropipeta puxado para quebrar as partículas de ferro agregada,transferi-los para um tubo de microcentrífuga, e lave-os várias vezes e cubra com água deionizada.
2. Para identificar as células ectodérmicas em um estágio HH 5 embrião, coloque o embrião colhida (ou seja, o conjunto inteiro de papel filtro) lado dorsal em uma placa de cultura 35 milímetros coberto com uma camada generosa de meios de cultura e colocar o prato sob um microscópio de dissecação. Use uma agulha de vidro para remover a membrana vitelina e expor as células ectodérmicas. (Tome cuidado para não furar embrião.)
3. Desenhar uma coluna de partículas de ferro rotulada (em água deionizada) em uma pipeta Pasteur. Usando o microscópio de dissecação submergir, a ponta da pipeta sob a superfície de líquidos ea posição um pouco acima do embrião. Rolando a pipeta lentamente para trás e para frente entre as pontas dos dedos, empurram as partículas para fora do pipiette e polvilhe-os através do embrião.
4. Uma vez que o embrião é coberta com partículas, cuidadosamente colocá-lo em uma incubadora de 37 ° C por aproximadamente 10 minutos. Tome embrião fora da incubadora umd usar um forte ímã para remover as partículas.
5. Use um microscópio de fluorescência com câmera de vídeo conectada e apropriado configurações de filtro para adquirir tanto de campo claro e imagens fluorescentes do embrião, como mostrado na Figura 2A, B.
6. Observe a densidade de etiqueta. Se uma distribuição mais densa é desejado, use partículas adicionais (como descrito acima) para rotular o embrião novamente e estender o tempo de incubação em conformidade. Se os rótulos são muito denso, adicione uma pequena quantidade de partículas de ferro não marcado para o tubo de microcentrífuga cheio de partículas já etiquetados e misturar o conteúdo do tubo. Repita o processo de etiquetagem com um novo embrião e, novamente, nota densidade rótulo.

3. Rotulagem de poliestireno Microesfera de Tomografia de Coerência Óptica (OCT) Imaging da HH11-12 embriões

1. Prepare uma solução de preto 10 mM diâmetro microesferas (Polysciences Inc., Warrington, PA) em PBS numa placa de Petri 35 mm. (Beads deve ser grande o suficiente para gerar contraste para outubroimagem, mas pequena o suficiente de modo que o tamanho do grânulo é da ordem de células individuais. Valores específicos variam de acordo com a resolução do seu sistema de outubro e os tecidos em estudo). Uma gota da solução-mãe (2,6% de sólidos de látex) por mL de PBS é geralmente suficiente. Puxe esta solução para uma seringa 10cc usando uma agulha de calibre 22. Vortex da solução por 30 segundos para assegurar uma distribuição uniforme do grânulo.
2. Bevel as pontas de suas agulhas de vidro puxado através de um disco rígido do computador ^2. Diâmetro da ponta deve ser grande o suficiente para que contas podem caber através da abertura, mas, ao mesmo tempo, tão pequeno quanto possível para minimizar ferindo o tecido durante a injeção.
3. Preencher uma agulha de vidro chanfrado com a solução de talão utilizando a seringa. Levemente o filme micropipeta para garantir que a solução atingiu a ponta.
4. Usando um micromanipulador, coloque a agulha de vidro no mesmo campo de visão como o embrião. Contas devem estar fluindo para fora da ponta da pipeta.
   1. Se não beads sair da micropipeta, pode haver uma obstrução. Neste caso, repita os passos de 3,2-3,4 com uma agulha de vidro novo.
   2. Se contas muitas nuvens o seu campo de visão, a sua ponteira pode ser muito grande. Repita os passos 3,2-3,4 com uma pipeta nova e um novo embrião.
5. Inserir a ponta da pipeta para o lúmen do tubo cérebro. Cuidado para não furar o chão ventral do tecido. Você verá um inchaço transitório do tecido como contas de e fluido entrar no lúmen. Isso indica uma intubação bem sucedida, agora, remover rapidamente a agulha de vidro.
6. Verificar uma densidade suficiente talão na luz interna do tubo cérebro usando um microscópio de campo claro. Deixe as contas para resolver 20 - 30 minutos antes de proceder à Sect. 4.

4. Aquisição de Dados

* Os seguintes métodos são adequados para a técnica de fluorescência de rotulagem descritos acima. No entanto, com a técnica de rotulagem microesfera, contas pode desalojar na transferência de amostrasentre incubadoras de empresas e sistemas de imagem. Neste caso o melhor é avançar para o passo 4.2 (o que evita a amostra movimento / agitação completamente). Em ambos os métodos, os embriões são cultivados ao mesmo tempo submerso em meio de cultura líquido. Se o embrião não é completamente submerso (como é o caso de algumas técnicas de cultura de tecido convencional), a geometria do tecido é grandemente alterada pela anormalmente cargas de superfície de alta tensão e distribuições tensão vai deixar de capturar com precisão morfogênese 3-D normal ^{3, 4.} Além disso, submergindo o tecido impede o contraste brilhante observada na interface líquido-gás durante outubro de imagens de obscurecer a morfologia embrionária e as coordenadas do marcador.

1. Cultura de embriões (geral)
   1. Depois de adquirir o seu primeiras imagens (de campo claro, fluorescência, ou outubro), colocar até sete pratos 35 milímetros de cultura (com embriões) em uma placa de Petri 150 mm e coloque o conjunto inteiro em um saco plástico pequeno. Adicione algumas gotas de água deionizada para a bolsa de umidificaçãoe encher o saco com um 95% O ₂ / 5% CO ₂ da mistura. Coloque os embriões na incubadora a 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, Carolina do Norte) para o tempo desejado até a próxima imagem timepoint. Usando este método, experimentos podem ser realizados em embriões múltiplos no mesmo dia.
2. Time-lapse cultura (automatizado)
   1. Coloque seu embriões rotulados em um prato T Delta (35 mm de diâmetro externo, 23 mm de abertura central, com parede lateral cônico, 0,17 milímetro de espessura de vidro; Bioptechs, Butler, PA), contendo 1,2 mL de meio de cultura.
   2. Cubra o prato com uma tampa de vidro mantida a 37 ° C usando um controlador Bioptechs Delta Dish T4 Cultura (para evitar a condensação). Superfuse o embrião com um 95% O ₂ / 5% CO ₂ fornecido mistura de gás de um dispositivo de fluxo Mini-Bomba Variável (Fisher Scientific). Antes de atingir o embrião, o calor e umidificar o gás por borbulhamento através de água deionizada em um quente (<100 ° C) chapa quente. Um esquema deste s experimentalet-up é mostrado na Figura 1.
   3. Configurar o software para adquirir automaticamente imagens em intervalos de tempo especificados pelo usuário. Para o nosso microscópio de fluorescência, usamos Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), e para o nosso sistema de outubro, usamos varreu fonte Thorlabs software (Newton, NJ). Como esse método é atualmente apenas capaz de lidar com uma experiência de lapso de tempo em um tempo, muitas vezes é melhor para permitir que estes tipos de culturas para executar durante a noite. Pode-se contornar essa limitação através da instalação de um palco automatizado traduzíveis compatível com o hardware eo software do sistema de imagens ^5.

5. Resultados representativos:

Etiquetas são rastreadas automaticamente (usando Volocity, PerkinElmer) ou manualmente (usando o plugin manual Rastreamento em ImageJ, NIH) em cada experimento. Na técnica de fluorescência, usamos o gridfit rotina Matlab para caber superfícies 2D através das coordenadas do marcador, o que permite cepas superfície morfogenética a ser calculada ^{6, 7.} Equações padronizadas são usadas para transformar esses valores em um sistema de coordenadas relevantes embrionárias. Alternativamente, na técnica de outubro, as superfícies são geradas a partir de volumes imagem segmentada (obtido via software padrão, como Matlab ou Caret ⁸⁾ e as tensões podem ser calculadas na direção de curvatura máximo ou mínimo da amostra ^9.

Usamos a nossa técnica de partículas de ferro para rotular e controlar o movimento de células ectodérmicas durante a formação da cabeça vezes no embrião de galinha cedo. Como mostrado na Figura 2A, células fluorescente etiquetado foram distribuídos em todo o embrião inteiro. Campo claro e imagens fluorescentes do embrião foram capturados em diferentes intervalos durante a cultura ovo ex. Os movimentos dos rótulos rastreados (Fig. 2B, C) foram então usados ​​para calcular as distribuições morfogenética evoluindo tensão durante a formação da cabeça dobra (Fig. 2D-F).

Figura 1. Esquemático de set-up para o lapso de tempo de cultura de tecidos.

Figura 2. Quantificar 2-D deformações do tecido no embrião de galinha cedo rastreados usando marcadores fluorescentes. (A) imagem brilhante Merged campo / fluorescente de HH embrião estágio 5 após a remoção de partículas de ferro. DII-labeled células ectodérmicas (vermelho) são distribuídos em todo o embrião inteiro. (B, C) O movimento de células marcadas foi monitorado usando ImageJ. Deslocamentos rótulo foram calculados em coordenadas embrião (X, Y). Note-se que A e B são a mesma imagem. (DF) parcelas Contour de evoluir distribuições deformação longitudinal durante a formação da cabeça desistir. Cepas longitudinal de Lagrange foram calculados em relação ao HH estágio 5 (ie, A e B) depois (D) 75 min, (E) 120 min, e (F) 165 min de incubação. Essas cepas caracterizar a variação do comprimento dos elementos da linha originalmente orientada ao longo do eixo Y (no embrião estágio 5). Mais detalhes sobre o uso do rótulo rastreado coordenadas para calcular cepas morfogenéticos podem ser encontrados em Filas et al (2007). ⁶ e Varner et al. (2010) ^7. Note-se que C e F são a mesma imagem. Barra de escala = 500 mm.

Figura 3. Quantificação de tecido 3-D deformations no cérebro pinto cedo. (A) de poliestireno microesferas que aderem à (seta preta) dorsal e ventral (seta branca) os lados do tubo do cérebro são facilmente discerníveis a partir de tecidos circundantes em vista transversal cruz section.Ventral de reconstruções outubro mostram locais micro perto do limite rombencéfalo mid- em (B) H12 e depois (C) 6 h de incubação (M: mesencéfalo, H: rombencéfalo). Vários grupos de contas são apresentadas para realçar a deformação total do tecido. (D) Longitudinal (E _zz) e circunferencial (E _θθ) cepas de Lagrange foram calculados a partir dessas deformações. Positivos e negativos longitudinal cepas circunferencial na fronteira meados de rombencéfalo refletem um crescimento axial e encurtamento circunferencial da região durante a cultura. Mais detalhes sobre o cálculo de tensões morfogenéticos para superfícies complexas durante a morfogênese pode ser encontrado em Filas et al. (2008) ^9. Barra de escala = 200 mM.

Duas técnicas de rotulagem de tecido são apresentados para a cultura ex ovo de embriões de galinha cedo. O primeiro usa corantes fluorescentes lipofílico entregues via partículas de ferro magnético para simultaneamente rótulo centenas de células. No entanto, este método não é compatível com tomografia de coerência óptica, como corantes fluorescentes mostram geralmente pouco contraste dos tecidos adjacentes utilizando ^{10 de outubro.} Por isso, vamos mostrar uma técnica alternativa utilizando o poliestireno microesferas de rotular tecidos para análise tempo-lapso outubro Esta técnica produz conjuntos de dados 3-D, mas é preciso ter cuidado para não deslocar as contas a partir do tecido. Usando um desses métodos na configuração apropriada experimental deve fornecer rotulagem tecido confiável e desenvolvimento em embriões de ovo ex cedo. Ambos os métodos utilizam prontamente disponível, de custo relativamente baixo de materiais (por exemplo, ferro em pó, microesferas de poliestireno) e permitir a deformação dos tecidos a serem quantificados durante a morfogênese. Omarcadores de tecido em ambos os casos podem ser facilmente reproduzível e aplicada a tecidos embrionários e não requerem equipamento especializado, fazendo com que essas experiências acessíveis aos recém-chegados no campo. Visualizar e analisar os dados resultantes (por exemplo, mapas de tensão de computação morfogenéticos) deve ajudar a iluminar os mecânicos da morfogênese no seu sistema modelo ^{6, 7, 9, 11, 12.}