Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

1. Cerebro rebanada preparación

1. Jóvenes (15-40 días) hombres y mujeres ratas Sprague-Dawley se utilizan. (También utilizamos este mismo protocolo en ratones.) Bajo anestesia profunda de uretano, los animales se decapitan y el cerebro es rápidamente disecados. De 300 micras de grosor del cerebro que contiene la parte coronal midrostral de la sustancia negra se cortan en un vibratome Leica (VT-1200S). El corte de corte procedimiento se realiza en un helado, sacarosa oxigenada de corte de alta solución que contiene (en mM): 220 sacarosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 _de NaHCO3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D- glucosa. Que se burbujea con una mezcla de 95% de CO O ₂ / _{2 al} 5% para mantener oxigenada y mantener un pH de 7,4. Mantenga la solución de corte helada durante todo el procedimiento.
2. Los cortes de cerebro se incuban en una cámara de incubación lleno de un líquido cefalorraquídeo artificial oxigenada (ACSF) que contiene (en mM): NaCl 125, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2,5 CaCl _2, 1,3 MgCl _2, 10 D-glucosa. Que se burbujea con una mezcla de 95% de CO O ₂ / _{2 al} 5% para mantener oxigenada y mantener un pH de 7,4. La temperatura de incubación es de 34 ° C durante 45 minutos y luego a temperatura ambiente hasta que la rebanada del cerebro se transfiere a la cámara de grabación.

2. Toma de huellas dactilares electrofisiológicos de las neuronas nigral

1. Una rebanada del cerebro se transfiere a una cámara de grabación de patch clamp continuamente perfundidos con la LCRa oxigenada a 32 ° C.
2. Pipetas de patch se extraen del autoclave borosilicato (KG-33) tubo capilar de vidrio (1,10 mm de diámetro, 1,65 mm de diámetro exterior, el rey de precisión de vidrio, Claremont, CA) usando un extractor de PC-10 (Narishige, Tokio, Japón) y se llena con solución intracelular preparado con DNasa libre de RNasa agua (Fisher Scientific) (que contiene 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl _2, pH ajustado a 7.3). Las pipetas de patch tienen resistencias de 3.2 mW en el baño.
3. La sustancia negra se identifica de acuerdo a su localización anatómica distinta (Fig. 1A1-2). Bajo la guía visual de un microscopio de vídeo (Olympus BX51W1), equipado con la óptica y la lente de 60X Nomarski inmersión en agua, las grandes células de la sustancia negra pars compacta (SNc) y la sustancia negra pars reticulata (SNR) (posible neuronas DA y las neuronas GABA) se seleccionan para la grabación. Convencionales giga-ohm sellado hermético de células enteras de configuración se obtiene (Fig. 1B1). Actual análisis de pinza de sujeción y la tensión se puede realizar. Para reducir al mínimo la degradación del ARNm, registro electrofisiológico debe ser breve (≤ 5 min). Una opción es único registro de la membrana y las propiedades de picos para facilitar las impresiones dactilares electrofisiológicos de las neuronas de los intereses (Fig. B2-3). Esta grabación breve demora sólo 1 min.

3. Citoplasma aspiración

1. Después de las huellas dactilares electrofisiológicos y caracterización de SNr GABA y las neuronas DA, la succión suave en la boca para aspirar el citoplasma. El núcleo de la célula también se puede aspirar, resultando en la contaminación de ADN genómico. El sello hermético que no sea quebrantada, restos de lo contrario extracelular incluyendo ARNm puede ser succionado por la pipeta de parches y contaminar el contenido de la celda. La integridad del cierre hermético es bueno siempre y cuando el aumento de la corriente de mantenimiento a -70 mV no exceda de 100 pA.
2. A continuación, el contenido de la celda aspirado es expulsado en un tubo de PCR de 0,2 ml por romper la punta de la pipeta y una presión positiva pequeña. Contenido de una célula se recoge en un tubo de PCR. Después de aceptar el contenido de la celda, la recogida de tubos PCR, pre-enfriado en hielo, se coloca inmediatamente en un congelador a -20 ° C.
3. Para descartar la contaminación de los desechos extracelulares que pueden contener los ARNm, el parche pipeta se introduce en el tejido sin llegar a aspirar el citoplasma y el contenido de la pipeta es sometido a RT-PCR.

4. La transcripción inversa (RT)

1. Después de recoger el contenido celular de un número razonable de las neuronas, por lo general 10-20, RT debe comenzar inmediatamente para reducir al mínimo la degradación del ARNm.
2. Dado que la cantidad de contenido de la celda de una sola neurona es demasiado pequeño, el procedimiento de aislamiento de ARN no se realiza. Para eliminar el potencial de contaminación de ADN genómico, el contenido de la celda es aspirado primero digerida por DNasa I (5 l de DNasa I y 1,6 l de DNasa I Buffer, 5 min a 25 ° C). Luego DNasa I se inactiva mediante la adición de 1,2 l de 25 mM EDTA y la incubación a 75 ° C durante 5 min.
3. ADNc se sintetiza con el superíndice III transcriptasa inversa basada en las células-Direct kit de síntesis de cDNA (Invitrogen, Tabla 1). Primera cadena de ADNc se sintetiza a 50 ° C durante 50 minutos, entonces la reacción es inactivada por incubación a 85 ° C durante 5 minutos y 1 l de RNasa H se agregaed de digerir ARNm (37 ° C durante 20 min). El cDNA de cadena simple se almacena a -20 ° C para la amplificación por PCR más tarde.
4. La eliminación completa de ADN genómico es verificada por RT-menos control en el que se omite la transcriptasa inversa, mientras que todos los componentes de la reacción otros eran exactamente iguales.

5. Dos etapas de amplificación de PCR

1. Primers fueron diseñados de acuerdo a las secuencias en el GenBank. Siempre que sea posible, intrón-que abarca pares de cebadores fueron utilizados que ayudan a detectar la contaminación de ADN genómico. Primer secuencias par se enumeran en la Tabla 2. La eficacia de los pares de cebadores debe ser primero verificado por el ARNm de todo el cerebro que producen productos positivo. Todos los cebadores se sintetizan en Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, EE.UU.).
2. En la primera etapa, 5 l de los 30 l ADNc se amplifica por 35 ciclos de la presencia de la pareja de cebadores (Tabla 2). Los ciclos térmicos protocolo del termociclador (MasterCycler, Eppendorf, Tabla 1) es de 2 min a 94 ° C para la desnaturalización inicial, luego 35 ciclos de 15 s a 94 ° C para desnaturalizar, 30 s, a 55 ° C para recocer, y 45 s a 72 ° C para extender, seguido de 7 minutos para una última prórroga. Taq polimerasa de ADN, desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), y todos los demás componentes necesarios para la amplificación de PCR son proporcionados por una mezcla súper PCR (Invitrogen, Tabla 1)
3. En la segunda etapa de PCR, el producto de 1 l de la 1 ^ª etapa de amplificación de PCR se utilizó como molde y el primer par mismo que se utiliza en la primera etapa se utiliza (Tabla 2). 40 ciclos se ejecutan con el tiempo de extensión reducido a 30 s. La misma mezcla de PCR super se utiliza.
4. Los productos PCR de la amplificación de 2 ^ª etapa se separan por electroforesis en gel de agarosa al 2,5%, visualizado por bromuro de etidio (0,05 mg/100 ml de gel) o gelgreen bajo la luz ultravioleta y fotografiados (Fig. B4). Las bandas son positivos entonces cortada, extraído por medio de un kit de extracción de Qiagen (Tabla 1) y secuenciado, y en comparación con las secuencias publicadas de los genes diana.

6. Los resultados representativos:

La dopamina (DA), las neuronas en la sustancia negra pars compacta y pars reticulata y la proyección de las neuronas vecinas GABA en la sustancia negra pars reticulata tienen distintas características electrofisiológicas (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Como se muestra en la figura. 1B2, SNr neuronas GABA muestran picos de frecuencia espontánea de alrededor de 10 Hz. Los picos tienen una duración base de alrededor de 1 ms. Tras la inyección de corriente hiperpolarizante, SNr neuronas GABA mostrar un hundimiento débil despolarización en respuesta a la hiperpolarización de inyección de corriente, lo que indica una débil expresión de la corriente I _h en estas neuronas (Fig. 1B2). Por el contrario, la sustancia nigra neuronas DA presentan baja frecuencia (alrededor de 2 Hz) picos espontáneos que tienen una duración base de alrededor de 3 ms. Neuronas DA también muestran un hundimiento pronunciado en respuesta a la hiperpolarización de inyección de corriente, lo que indica una fuerte expresión de I _h corriente (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011).

SCRT-PCR detectó ARNm de la decarboxilasa del ácido glutámico 1 (GAD1, la enzima clave para la síntesis de GABA y un marcador para las neuronas GABA) en electrofisiológicamente identificado las neuronas GABA SNr, pero no en las neuronas DA (Fig. 1B4, 5). Por el contrario, SCRT-PCR detectó ARNm de la tirosina hidroxilasa (TH, enzima clave para la síntesis de dopamina y un marcador de neuronas DA) en electrofisiológicamente identificado SNC y las neuronas DA SNr, pero no en las neuronas GABA (Fig. 1B4, 5). Así SCRT-PCR resultados confirman la identificación de las neuronas electrofisiológicos. A continuación, SCRT-PCR se utilizó para el perfil de la expresión de la tensión activa KV3 subunidades canal Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4. Estas subunidades contribuyen a formar voltaje canales de K ⁺ de diversas propiedades en función de la composición de la subunidad (Ding et al. 2011). En el ejemplo SNr GABA neurona se muestra en la figura. 1B4, mRNAs de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron. En el ejemplo SNr DA neurona se muestra en la Fig.1B5, sólo Kv3.2 Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron. En los datos agrupados, Kv3.1 fue más frecuentemente detectados en SNr neuronas GABA que en nigral neuronas DA, lo que indica un mayor nivel de expresión de Kv3.1 en la rápida adición neuronas GABA SNr (Ding et al. 2011).

Figura 1. Identificación electrofisiológica de las neuronas GABA SNr y las neuronas nigral DA A:.. Nigral áreas pueden ser identificadas por su localización anatómica distinta A1 muestra la ubicación del SNC y SNR en una corona manchada de Nissl sección capturado con un objetivo 1X. El área de caja se CAPTURed con un objetivo 10X y se muestra en el centro como indica la flecha. La SNC rico en células y células de los pobres SNr son claramente visibles. A2 muestra la ubicación de SNc y SNR en una sección en vivo, sin manchas coronal capturado con un objetivo de 4X. La SNC rico en células y células de los pobres SNr son claramente identificables. VTA, el área tegmental ventral. B1 muestra un parche de neuronas GABA SNr se sujeta en su conjunto de células modo. B2 se muestran las propiedades típicas electrofisiológicas de las neuronas GABA SNr en el modo actual de grabación de sujeción. Estas neuronas espontáneas de alta frecuencia potencial de acción de corta duración y tienen una débil que _h respuesta mediada por el hundimiento de hiperpolarización de inyección de corriente. B3 muestra típica de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas DA nigral en el modo actual de grabación de sujeción. Se incendio espontáneo bajos potenciales de acción de frecuencia de larga duración y tienen un prominente I _h mediada por el SAG (cabeza de flecha) respuesta a la hiperpolarización de inyección de corriente. Por lo tanto, SNr neuronas GABA y las neuronas de dopamina nigral están claramente identificados electrofisiológica. B4 muestra una imagen del gel de SCRT-PCR de un electrofisiológicos identificaron las neuronas GABA SNr. Glutamato decarboxilasa 1 (GAD1) ​​mRNA, pero no tirosina hidroxilasa (TH) mRNA se detectó. mRNAs de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron en este neuronas GABA SNr. B5 muestra SCRT-PCR la detección de ARNm canal neuronal KV3 en una neurona SNr DA. ARNm de TH, pero no ARNm GAD1 se detectó en un electrofisiológicamente identificado las neuronas DA SNr. mRNAs de Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron en este SNr DA neuronas. B6 muestra los datos agrupados.

7. Posibles resultados falsos negativos y falsos positivos

Basándonos en nuestra experiencia, varios factores pueden dar lugar a falsos negativos SCRT-PCR resultados. Estos factores incluyen la falta de aspiración en cantidad suficiente del citoplasma, debido a la obstrucción de parches punta de la pipeta, la contaminación RNasa e ineficiente PCR. Parche obstrucción punta de la pipeta por lo general se puede ver en el monitor de vídeo y señalados por la resistencia a un mayor acceso. RNasa contaminación se puede evitar la desactivación completa y el uso de guantes. La eficacia de PCR de la imprimación debe ser probada mediante el uso de ARN total de tejido cerebral un golpe de puño (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011).

Ya que siempre uso para el tratamiento de primera DNasa nuestras muestras antes de RT, no hemos encontrado resultados positivos falsos. En teoría, sin la digestión DNasa, contaminación de ADN genómico y por lo tanto la detección de falsos positivos pueden ocurrir cuando el gen se intronless o el primer par no abarca la región intrón.

La combinación de la grabación de patch clamp en cortes de cerebro con SCRT-PCR hemos demostrado aquí proporcionan un excelente método para investigar los perfiles de expresión de mRNA de los canales iónicos, receptores y las enzimas clave para la síntesis de neurotransmisores en las neuronas caracteriza individualmente. Esto es particularmente útil cuando la proteína en cuestión no puede ser detectado y localizado por otros métodos como la inmunohistoquímica debido al bajo nivel de expresión y / o la falta de anticuerpos adecuados (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). La alta sensibilidad y selectividad de SCRT-PCR permiten la detección de ARNm de baja abundancia (Surmeier et al. 1996). Además, este método permite la correlación de la expresión génica con propiedades electrofisiológicas y funcionales en las neuronas caracteriza individualmente (Liss et al 2001;. Zhou et al 2008, 2009;. Ding et al 2011).. Con base en evidencia en la literatura y nuestra experiencia, este método es aplicable a todos los tipos de neuronas en el sistema nervioso.