Profilering spänningskänsliga Kalium Expression Kanal mRNA i Nigral nervceller med hjälp av encelliga RT-PCR-teknik

1. Brain skiva förberedelse

1. Unga (15-40 dagar gammal) manliga och kvinnliga Sprague-Dawley används. (Vi använder samma protokoll i möss.) Enligt djupt uretan anestesi, är djur halshuggen och hjärnan snabbt dissekeras ut. Sedan 300 um tjock koronalt hjärnan skivor som innehåller midrostral del av substantia nigra skärs på en Leica vibratome (VT-1200-talet). Segmentet skärande proceduren utförs i en iskall, syresatt hög sackaros lösning för kapning som innehåller (i mm): 220 sackaros, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D- glukos. Det bubblade med en blandning av 95% O ₂ / 5% CO ₂ för att hålla syresatt och bibehålla pH på 7,4. Håll lösning för kapning iskall under hela förfarandet.
2. Hjärnan skivor inkuberas i en inkubation kammare fylld med en syre-artificiella cerebrospinalvätska (aCSF) som innehåller (i mm): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2,5 CaCl _2, 1,3 MgCl _2, 10 D-glukos. Det bubblade med en blandning av 95% O ₂ / 5% CO ₂ för att hålla syresatt och bibehålla pH på 7,4. Inkubationstemperaturen är 34 ° C i 45 min och därefter i rumstemperatur tills hjärnan slice överförs till inspelningen kammaren.

2. Elektrofysiologiska fingeravtryck av nigral nervceller

1. En hjärna skiva överförs till en patch clamp inspelning kammare kontinuerligt perfusion med syresatt aCSF vid 32 ° C.
2. Patch pipetter dras från autoklaveras borosilikatglas (KG-33) glas kapillär slang (1,10 mm id, 1,65 mm OD, King Precision Glas, Claremont, Kalifornien) med hjälp av en PC-10 avdragare (Narishige, Tokyo, Japan) och fylld med intracellulära lösning förberedd med DNas-RNase-fritt vatten (Fisher Scientific) (som innehåller 135 mm KCl, 0,5 mm EGTA, 10 mm HEPES, 1,5 mM MgCl _2, pH justeras till 7,3). Plåstret pipetter har motstånd på 2-3 Mohm i badet.
3. Substantia nigra identifieras i enlighet med dess distinkta anatomiska läge (bild 1A1-2). Under visuell ledning av en video mikroskop (Olympus BX51W1) utrustade med Nomarski optik och 60X nedsänkning i vatten lins, stora celler i substantia nigra pars compacta (SNC) och substantia nigra pars reticulata (SNR) (möjligt DA neuron och GABA-neuron) är valda för inspelning. Konventionella giga ohm tätt helcells-konfiguration erhålles (bild 1B1). Strömtång och spänning klämma analyser kan utföras. För att minimera mRNA nedbrytning bör elektrofysiologiska inspelning vara kortfattad (≤ 5 min). Ett alternativ är att endast spela in i membranet och standardtillsatser egenskaper för att ge elektrofysiologiska fingeravtryck för nervceller av intressen (Fig. B2-3). Denna korta inspelning tar bara ca 1 min.

3. Cytoplasman aspiration

1. Efter elektrofysiologiska fingeravtryck och karakterisering av SNR GABA och DA nervceller, är skonsam munnen sug tillämpas aspirera cytoplasman. Cellkärnan kan också vara aspireras, vilket resulterar i genomisk DNA kontaminering. Den tätning bör inte brytas, annars extracellulärt skräp inklusive mRNA kan sugas in i patchen pipetten och förorena cellens innehåll. Integriteten för tätt är bra så länge som ökningen av hållström vid -70 mV inte överstiger 100 PA.
2. Därefter aspireras cellinnehållet är utvisade i en 0,2 ml PCR-rör genom att bryta pipettspetsen och ett litet övertryck. En cellens innehåll samlas i en PCR-rör. Efter att acceptera cellens innehåll, den samlar PCR rör nedkylda på is, är omedelbart placeras i en -20 ° C frys.
3. För att utesluta förorening av extracellulärt skräp som kan innehålla mRNA är plåstret pipetten sänks ner i vävnaden utan att aspirering cytoplasman och sedan innehållet i pipetten utsätts för RT-PCR.

4. Omvänd transkription (RT)

1. Efter samla cell innehåll från ett rimligt antal neuroner, vanligtvis 10-20, bör RT inledas omedelbart för att minimera nedbrytning av mRNA.
2. Eftersom mängden av cellens innehåll från en enda neuron är för liten, är RNA isolering förfarandet inte utförs. För att ta bort eventuella kontaminerande genomiska DNA är aspirerade cellen innehållet först smältas av DNase I (5 mikroliter DNase I och 1,6 mikroliter DNas Jag buffert, 5 min vid 25 ° C). Sedan DNas jag inaktiveras genom att lägga 1,2 mikroliter 25 mM EDTA och inkuberas vid 75 ° C i 5 min.
3. cDNA syntetiseras med Upphöjd III omvänt transkriptas-baserade celler-Direct cDNA syntes kit (Invitrogen, tabell 1). Första programområdet cDNA syntetiseras vid 50 ° C i 50 min, då reaktionen inaktiveras genom inkubation vid 85 ° C i 5 min och 1 mikroliter RNase H är att läggaED att smälta mRNA (37 ° C i 20 minuter). Det enkelsträngade cDNA lagras vid -20 ° C för senare PCR-amplifiering.
4. Fullständigt avlägsnande av arvsmassans DNA verifieras med RT-minus kontroll där omvänt transkriptas utelämnas, medan alla andra reaktion komponenterna har exakt samma.

5. Tvåstegs PCR-amplifiering

1. Primers var utformade enligt de sekvenser i GenBank. När det är möjligt, var intron-spänner primerpar använts som hjälper upptäcka arvsmassans DNA kontamination. Primer par sekvenser visas i tabell 2. Effektiviteten i primerpar bör först kontrolleras av hela hjärnan mRNA som ger positiva produkter. Alla primers syntetiseras av Integrated DNA-teknik (Coralville, Iowa, USA).
2. I det första skedet är 5 mikroliter av 30 mikroliter cDNAs förstärks i 35 cykler i närvaro av primer par (tabell 2). Den termiska cykling protokollet för värmecykeln (MasterCycler, Eppendorf, tabell 1) är 2 minuter vid 94 ° C för den första denaturering, därefter 35 cykler av 15 s vid 94 ° C för att denaturera, 30 s vid 55 ° C för att glödga, och 45 s vid 72 ° C för att förlänga, följt av 7 min för en slutlig förlängning. Taq DNA-polymeras, deoxinukleotidtrifosfater (dNTPs), och alla andra komponenter som krävs för PCR-amplifiering tillhandahålls av en PCR-super mix (Invitrogen, tabell 1)
3. I det andra steget PCR, är produkten av en mikroliter från 1: ^a etappen PCR-amplifiering används som mall och samma grundfärg paret som används i det första skedet används (tabell 2). 40 cykler drivs med filändelsen tiden förkortas till 30 s. Samma PCR super mix används.
4. PCR-produkter från den 2: ^a etappen förstärkningen är åtskilda med 2,5% agarosgelelektrofores, visualiseras genom etidiumbromid (0,05 mg/100 ml gel) eller gelgreen under UV-ljus, och fotograferade (Fig. B4). Den positiva band sedan skärs ut, utvinns med hjälp av en Qiagen extraktion kit (tabell 1) och sekvenseras och jämföras med publicerade sekvenser av målet gener.

6. Representativa resultat:

Dopamin (DA) nervceller i substantia nigra pars compacta och Pars reticulata och den angränsande GABA nervceller projektion i substantia nigra pars reticulata har skilda elektrofysiologiska egenskaper (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011.). Som visas i figur. 1B2, SNR GABA neuroner uppvisar hög frekvens spontana tillsatta runt 10 Hz. De spikar har en bas varaktighet ca 1 ms. Vid hyperpolarizing aktuella injektion, SNR GABA nervceller visa en svag depolariserande SAG som svar på hyperpolarizing aktuella injektion, vilket indikerar en svagt uttryck för jag _h aktuell i dessa nervceller (bild 1B2). Däremot nigral DA nervceller uppvisar låg frekvens (ca 2 Hz) spontana spikar som har en bas längd ca 3 ms. DA nervceller visar också en uttalad SAG som svar på hyperpolarizing aktuella injektion, vilket tyder på ett starkt uttryck av I _h nuvarande (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006,.. Ding et al 2011).

SCRT-PCR detekteras mRNA för glutaminsyradekarboxylas 1 (GAD1, den viktigaste enzymet för GABA-syntesen och en markör för GABA-neuron) i elektrofysiologiskt identifierade SNR GABA nervceller, men inte i DA neuron (Fig. 1B4, 5). Däremot upptäcktes SCRT-PCR mRNA för tyrosin hydroxylas (TH, nyckel enzym för dopamin syntes och en markör för DA neuron) i elektrofysiologiskt identifierade SNC och SNR DA nervceller, men inte i GABA-neuron (Fig. 1B4, 5). Så SCRT-PCR-resultat bekräftar elektrofysiologiska neuron identifiering. Därefter var SCRT-PCR används för att profilera uttryck för spännings-aktiverade KV3 kanal subenheter, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 och Kv3.4. Dessa subenheter bidrar till att bilda spänningskänsliga K ^+-kanaler av olika egenskaper beroende på subenheten sammansättning (Ding et al. 2011). I exemplet SNR GABA neuron visas i bild. 1B4, mRNA för Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 och Kv3.4 upptäcktes. I exemplet SNR DA neuron som visas i Fig.1B5, bara Kv3.2, Kv3.3 och Kv3.4 upptäcktes. I vår poolade data, var Kv3.1 oftare upptäcks i SNR GABA neuroner än i nigral DA nervceller, vilket indikerar en högre uttryck nivå Kv3.1 på den snabbt tillsatta SNR GABA neuroner (Ding et al. 2011).

Figur 1. Elektrofysiologiska identifiering av SNR GABA nervceller och nigral DA nervceller A:.. Nigral områden kan identifieras genom sina olika anatomiska läge A1 visar var SNC och SNR i en korona Nissl-färgade delen tagits med en 1X mål. Det inramade området var capturED med 10X objektiv och visas i mitten angivits som av pilen. Cellen-rika SNC och cell-fattiga SNR är tydligt synliga. A2 visar var SNC och SNR i en levande, ofärgade koronalt avsnitt tagits med en 4X mål. Cellen-rika SNC och cell-fattiga SNR är också tydligt identifierbara. VTA, ventrala tegmentumområdet. B1 visar en SNR GABA-neuron som plåster fastklämd i helcells-läge. R2 visar den typiska elektrofysiologiska egenskaper SNR GABA nervceller i strömtång inspelningsläge. Dessa nervceller brand spontana hög frekvens aktionspotentialens kortvariga och har en svag jag _h-medierad sag svar på hyperpolarizing aktuella injektion. R3 visar typiska elektrofysiologiska egenskaper nigral DA nervceller i strömtång inspelningsläge. De brand spontana låga potentialer frekvens åtgärder under lång tid och har en framträdande I _h-medierad SAG (pilspets) svar på hyperpolarizing aktuella injektion. Således är SNR GABA nervceller och nigral nervceller dopamin tydligt elektrofysiologiskt. B4 visar en gel bild av SCRT-PCR-produkter från ett identifierat elektrofysiologisk SNR GABA neuron. Glutamat decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNA, men ingen Tyrosin hydroxylas (TH) mRNA upptäcktes. mRNA för Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 och Kv3.4 upptäcktes i denna SNR GABA neuron. B5 visar SCRT-PCR detektion av neuronala KV3 kanal mRNA i ett SNR DA neuron. TH mRNA men ingen GAD1 mRNA upptäcktes i ett elektrofysiologiskt identifierat SNR DA neuron. mRNA för Kv3.2, Kv3.3 och Kv3.4 upptäcktes i denna SNR DA neuron. R6 visar poolade data.

7. Potentiella falskt negativa och falska positiva resultat

Baserat på vår erfarenhet kan flera faktorer leda till falskt negativa SCRT-PCR-resultat. Dessa faktorer inkluderar fel i aspirerande tillräcklig mängd cytoplasman på grund av plåster pipettspetsen igensättning, RNase föroreningar och ineffektivt PCR. Patch pipettspetsen igensättning vanligtvis kan ses på bildskärm och indikeras av ökad tillgång motstånd. RNas förorening kan undvikas genom noggrann avaktivering och handskar. PCR primer effektivitet bör testas med hjälp av total RNA från en hjärnvävnaden Punch (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011).

Eftersom vi alltid använder DNas att först behandla våra prover innan RT, vi har stött på inte falskt positiva resultat. Teoretiskt, utan DNas matsmältning, inte span genomiska DNA föroreningar och därmed falsk positiv detektion kan uppstå när genen är intronless eller primern paret inte intron regionen.

Kombinationen av patch clamp inspelning i hjärnan skiva med SCRT-PCR vi visat här ger en utmärkt metod för att undersöka profilerna mRNA uttryck för jonkanaler, receptorer och viktiga enzymer för neurotransmittorn syntes i individuellt präglas nervceller. Detta är särskilt användbart när proteinet i fråga inte kan upptäckas och lokaliseras med hjälp av andra metoder såsom immunohistokemi på grund av låg uttryck nivå och / eller brist på lämpliga antikropp (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). Den höga känslighet och selektivitet SCRT-PCR kan upptäckas liten förekomst mRNA (Surmeier et al. 1996). Dessutom möjliggör denna metod sambandet mellan genuttryck med elektrofysiologiska och funktionella egenskaper karakteriseras individuellt nervceller (Liss et al 2001;. Zhou et al 2008, 2009;. Ding et al 2011.). Baserat på litteratur bevis och vår erfarenhet är denna metod som används vid varje neuron typer i nervsystemet.