ड्रोसोफिला पोटा संबंधी पेट immunohistochemistry

Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), e3139, doi:10.3791/3139 (2011).

ड्रोसोफिला पोटा संबंधी पेट एक स्थापित उपकला morphogenesis और यौन dimorphic ^1-3 morphologies के विकास के अध्ययन के लिए मॉडल प्रणाली है. प्यूपीकरण है, जो 96 लगभग घंटे spans (25 डिग्री सेल्सियस) के दौरान, imaginal कोशिकाओं के proliferating आबादी लार्वा epidermis की जगह के लिए वयस्क पेट क्षेत्रों उत्पन्न. इन imaginal कोशिकाओं, embryogenesis दौरान पैदा हुए, लार्वा के प्रत्येक पेट खंड में histoblast घोंसले के पार्श्व जोड़े के रूप में मौजूद है. Histoblast घोंसले के चार जोड़े वयस्क पृष्ठीय छल्ली (पूर्वकाल और कूल्हों पृष्ठीय घोंसले), वेंट्रल छल्ली (ventral घोंसले) और प्रत्येक खंड (झरोखा घोंसले) ⁴ के साथ जुड़े spiracles को जन्म दे. Puparation पर, इन द्विगुणित कोशिकाओं (बड़ा polyploid लार्वा epidermal कोशिकाओं LECs से आकार से अलग पहचाना) प्रसार, प्रवास, और LECs के प्रतिस्थापन की एक टकसाली प्रक्रिया शुरू करते हैं. विभिन्न उपकरण आणविक और आनुवंशिक आनुवंशिक वयस्क पेट के morphogenesis में शामिल रास्ते के योगदान की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. परम वयस्क phenotypes आम तौर पर वयस्क पेट cuticles के निम्नलिखित विच्छेदन विश्लेषण कर रहे हैं. हालांकि, अंतर्निहित प्रक्रियाओं आणविक की जांच पोटा संबंधी उपकला, जो वर्तमान अद्वितीय चुनौतियों का immunohistochemical विश्लेषण की आवश्यकता है. अस्थायी गतिशील morphogenesis और दो अलग उपकला आबादी (लार्वा और imaginal) की बातचीत एक नाजुक विच्छेदन और बाद के प्रसंस्करण के दौरान अत्यधिक सेल घटाने के लिए प्रवण ऊतक उत्पन्न करते हैं. हम विच्छेदन, निर्धारण, बढ़ते और ड्रोसोफिला immunohistochemical अध्ययन है कि लगातार उच्च गुणवत्ता confocal या मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त नमूने उत्पन्न के लिए पोटा संबंधी abdominem उपकला के इमेजिंग के तरीके विकसित किया है.

1. दिवस 1

इससे पहले कि आप शुरू:

मक्खियों का एक स्वस्थ जनसंख्या मानक संवर्धन प्रोटोकॉल का उपयोग कर बनाए रखा जाना चाहिए: अंडे करना और विकास एक निरंतर तापमान ^पर भटक 3 Rd instar लार्वा pupariation आरंभ जब तक आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं 3-4 दिनों के बाद बोतल या शीशियों से वयस्कों को हटाने. लार्वा / पोटा संबंधी संक्रमण prepupae (0 घंटे गठन-APF puparium के बाद माना) के गठन के द्वारा चिह्नित है. स्थिर pupae उनके सफेद रंगाई द्वारा बड़े pupae से और है कि अभी तक उनके आयताकार, गोल आकार और पूर्वकाल spiracles के फलाव द्वारा pupariation नहीं शुरू कर दिया है लार्वा से प्रतिष्ठित हैं.

आप की आवश्यकता होगी:

• Pupae इकट्ठा करने के लिए एक पेंट ब्रश
• संवर्धन pupae के लिए एक नम कक्ष: एक पेट्री डिश गीला कागज तौलिया के साथ पंक्तिवाला और फिल्टर संग्रह, या pupae के जीनोटाइप सेक्स के विभिन्न समय के अंक के लिए चिह्नित कागज के साथ कवर
• 1X फास्फेट pupae धोने के लिए खारा (पीबीएस) buffered

संग्रह संवर्धन, मचान और pupae

1. एक गीला तूलिका का प्रयोग धीरे संस्कृति की बोतलें / शीशियों से 0hr APF pupae हटाने और उन्हें नम चैम्बर के ढक्कन में जगह.
2. 1X और पीबीएस तूलिका का प्रयोग धीरे pupae धोने के लिए कोषस्थ कीट मामले से मलबा हटाने
3. यदि आवश्यक सॉर्ट सेक्स से pupae. pupae के जननपिंड primordia लिंगों को सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पुरुष जननपिंड primordia पारभासी आसानी से लगभग 2 / ³ 5 शरीर की लंबाई नीचे पोटा संबंधी छल्ली के माध्यम से देखा डिस्क की एक पार्श्व जोड़ी हैं. महिला जननपिंड primordia छोटे हैं और पहचान के रूप में आसानी से नहीं.
4. उमस भरे कक्ष में उचित रूप से लेबल की स्थिति में pupae प्लेस और लगातार तापमान में लौटने. उचित विकास समय बिंदु संस्कृति.

2. दिन 2: विच्छेदन निर्धारण, और प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन

इससे पहले कि आप शुरू:

आप की आवश्यकता होगी:

• विच्छेदन stereomicroscope
• सर्जिकल संदंश
• 11 ब्लेड संख्या के साथ सर्जिकल स्केलपेल
• नौ अच्छी तरह से दो गिलास अवसाद व्यंजन (Corning उत्पाद # 7220-85)
  • 1X पीबीएस के साथ एक डिश के कुओं को भरें: यह dissected pupae की सफाई के लिए rinsing के पकवान है
  • निर्धारण बफर के साथ दूसरे डिश के कुओं भरें
• एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए नम चैम्बर. हम प्लास्टिक sealable सैंडविच गीला कागज तौलिये के साथ लाइन बक्से का उपयोग करें.
• फिक्सेशन बफर: 1x पीबीएस, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic एसिड (permeabilization के लिए)
• विच्छेदन मंच: डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा एक तरफ पालन के साथ साफ खुर्दबीन स्लाइड
• 1X पीबीएस
• P100 या P200 pipettor

विच्छेदन

1. संदंश का प्रयोग धीरे एक समय में pupae एक हटाने और टेप के विस्तृत चौड़ाई का सामना करना पड़ pupae के पूर्वकाल अंत के साथ विच्छेदन मंच पर उन्हें जगह. यदि pupae जरूरत से ज्यादा गीला कर रहे हैं, उन्हें एक कागज तौलिया का उपयोग कर शुष्क पहली दाग.
2. इससे पहले pupae को पूरी तरह से टेप करने के लिए पालन किया है, एक तूलिका का उपयोग करने के लिए उन्हें स्थिति.
3. शुष्क हवा pupae अनुमति दें और टेप (5-10 मिनट) का पालन
4. शल्य चिकित्सा स्केलपेल के साथ प्रत्येक pupae द्विपक्षीय टुकड़े करना. यह सबसे अच्छा एक एकल पूर्वकाल से pupae के पीछे अंत करने के लिए तेजी से कटौती के साथ पूरा किया है. अगर ठीक से किया है, कट दोनों पूर्वकाल और कूल्हों spiracles जोड़े द्विविभाजित करना होगा. धोने और सफाई नमूने जल्दी proteolytic ऊतकों को नुकसान को रोकने के आवश्यक है के रूप में एक समय में कोई 10 से अधिक pupae काटना.
5. एक तूलिका का प्रयोग, प्रत्येक dissected pupae 1X पीबीएस की एक छोटी राशि स्थानांतरण करने के लिए उन्हें टेप से ढीला.

सफाई निर्धारण, और प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन

6. शल्य चिकित्सा संदंश की एक जोड़ी के साथ एक व्यक्ति कोषस्थ कीट आधा पूर्व से समझ और तुरंत यह rinsing के पकवान की एक अच्छी तरह से में विसर्जित. विच्छेदन मंच खुर्दबीन मंच पर पकवान rinsing द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. pupae मामले नमूने पर छोड़ दिया जाना चाहिए जब तक प्रसंस्करण पूरा हो गया है और नमूनों बढ़ते के लिए तैयार हैं.
7. हालांकि अभी भी लोभी कोषस्थ कीट आधा एक pipettor का उपयोग करने के लिए धीरे दूर पेट की आंतरिक ऊतक धोने. धोने के दौरान बहुत ज्यादा दबाव उपकला कोशिकाओं के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
8. तत्काल नियतन बफर करने के लिए कमरे के तापमान पर साफ कोषस्थ कीट आधा और हस्तांतरण शेष कोषस्थ कीट आधा इसी तरह की प्रक्रिया. अभ्यास विच्छेदन, और 20 कोषस्थ कीट आधा की धुलाई के साथ कम से कम 5 मिनट लग चाहिए.
9. Pupae निर्धारण बफर में कमरे के तापमान पर 1 (एक) घंटे के लिए सेते दें.
10. 1X पीबीएस में तय pupae 3x पांच मिनट कुल्ला
11. नमूने तुरंत immunohistochemistry के लिए संसाधित किया जा सकता है या 100% इथेनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कोशिकाओं या मिलान जेट की हानि के बिना करने के लिए 3 महीने के लिए हो सकता है.
12. नमूनों की दुकान करने के लिए, एक कमजोर पड़ने के माध्यम से नमूने संतुलित करनापीबीएस की श्रृंखला: 100% EtOH करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए पहले प्रत्येक कमजोर पड़ने में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर EtOH (03:01, 01:01, 01:03).
13. नमूने पुनः equilibrated पीबीएस में immunohistochemistry के लिए प्रसंस्करण से पहले रिवर्स श्रृंखला के माध्यम से किया जाना चाहिए.
14. 1x पीबीएस (2% गोजातीय सीरम albumin के साथ पूरक) नमूने प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा पहले 1 (एक) घंटे के लिए ब्लॉक.
15. प्राथमिक 1X पीबीएस में 4 बजे रात से अधिक उपयुक्त एकाग्रता को पतला एंटीबॉडी ° सी घोड़ा के बिना के साथ सेते हैं.

3. 3 दिन: माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन, बढ़ते और इमेजिंग

इससे पहले कि आप शुरू:

आप की आवश्यकता होगी:

• दो शल्य चिकित्सा संदंश
• बढ़ते मीडिया (ग्लिसरॉल, Vectashield [वेक्टर लैब्स], या Slowfade गोल्ड [Invitrogen])
• अवसाद अच्छी तरह खुर्दबीन स्लाइड (0.8 मिमी)
• Coverslips (24 x 40 मिमी)

माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन और बढ़ते:

1. नमूने धो 3x 10 मिनट 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक
2. 1x पीबीएस (2% गोजातीय सीरम albumin के साथ पूरक) नमूने माध्यमिक एंटीबॉडी के अलावा पहले 1 (एक) घंटे के लिए ब्लॉक.
3. माध्यमिक 1X पीबीएस में उचित एकाग्रता के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान में 3 घंटे (तीन) के लिए कमाल के बिना पतला एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
4. नमूने धो 3x 10 मिनट 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक
5. यदि उपयुक्त हो, counterstain pupae (उदाहरण हम DAPI साथ नाभिक दाग [4 ',6-diamidino-2 - phenylindole] पीबीएस में 10 मिनट के लिए पतला).
6. बढ़ते से पहले उपयुक्त मीडिया में नमूने (30 मिनट के न्यूनतम) समतोलन करना.
7. एक नमूना स्लाइड तैयार करें. pupae की आकारिकी फ्लैट बढ़ते रोकता है. नमूने इमेजिंग के लिए एक अवसाद स्लाइड (ड्रॉप स्लाइड) के कुएं में बढ़ रहे हैं. अच्छी तरह से अवसाद में बढ़ते मीडिया के 75 100ul प्लेस. कई नमूने एक एकल स्लाइड पर रखा जा सकता है है.
8. कोषस्थ कीट मामले बढ़ते पहले नमूने से हटाया जाना चाहिए. मुट्ठी एक व्यक्ति कोषस्थ कीट मामले पूर्व से आंतरिक पोटा संबंधी झिल्ली नहीं समझ सुनिश्चित किया जा रहा है.
9. संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ धीरे सिर द्वारा आंतरिक पोटा संबंधी झिल्ली समझ और यह पोटा संबंधी मामले से हटा दें.
10. तुरंत अवसाद नमूना अच्छी तरह से हस्तांतरण और अतिरिक्त नमूनों की प्रक्रिया जारी है.
11. नमूने समान अवसाद में पार्श्व सतह का सामना करना पड़ के साथ एक जांच या संदंश स्थिति का उपयोग करना. समसामयिक हवाई बुलबुले एक जांच के साथ हटाया जा सकता है है.
12. धीरे देखभाल लेने के नमूने पर coverslip कम करने के लिए हवाई बुलबुले नहीं परिचय

4. प्रतिनिधि परिणाम:

नमूने का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल बनाए रखने वयस्क पेट के सकल आकारिकी तैयार. छवि के ढेर के लिए एक दो आयामी छवि या 3 - डी प्रतिपादन पेट टोपोलॉजी की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है उत्पन्न करने के लिए पेश किया जा सकता है.

चित्रा 1. विभाजन ड्रोसोफिला pupae में जीन Wingless प्रोटीन और Engrailed अभिव्यक्ति (एन gal4: UAS - GFP) उत्पादों.: और विरोधी GFP puparium गठन के बाद 26 घंटे (APF) पर माउस विरोधी विंग (आयोवा हाइब्रिडोमा बैंक 4D4) के साथ कल्पना थे . 10x बढ़ाई, पूर्वकाल छोड़ दिया है और पृष्ठीय ऊपर है. Nucleii DAPI के साथ counterstained थे.

लगभग 50 छवियों (स्लाइस के बीच ΔZ 2.5μm है) के ढेर अनुमान थे.

इस वीडियो में प्रस्तुत तकनीक विकासात्मक समय अंक की एक किस्म से ड्रोसोफिला pupae तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 24 घंटे की अवधि APF के दौरान 32 घंटे तक संसाधित pupae APF सबसे उपकला से सेल घटाने के लिए प्रवण हैं. डिटर्जेंट की विस्तारित ऊष्मायन चरणों के दौरान (जैसे ट्राइटन X-100 और बीच-20 के रूप में) का उपयोग करें सेल हानि की संभावना बढ़ जाती है और इसलिए की सिफारिश नहीं है. बल्कि, deoxycholic एसिड एक साबुन के रूप में निर्धारण प्रारंभिक चरण के दौरान प्रयोग किया जाता है. 1X पीबीएस में डिटर्जेंट के बिना सभी बाद के चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं. इसके अलावा, विस्तारित ऊष्मायन चरणों के दौरान नमूने कमाल सेल नुकसान बढ़ता है और बचा जाना चाहिए.

नमूने confocal माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग imaged किया जा सकता है. हालांकि, ड्रोसोफिला pupae संसाधित है के रूप में वर्णित भी एक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी confocal तकनीक करने के लिए तुलनीय छवि गुणवत्ता उपज प्रणाली का उपयोग imaged किया जा सकता है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

1. Kopp, A. & Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
2. Ninov, N., Chiarelli, D.A., & Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
3. Bischoff, M. & Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
4. Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen (Pergamon Press Oxford, 1976).
5. Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).

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