Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

1. Voorbereiding van de Solutions

Voor het uitvoeren van hydroxyapatiet chromatografie, moet fosfaat buffers worden voorbereid en het hydroxyapatiet moeten goed gehydrateerd.

1. 1M-fosfaat-oplossing, pH 6.8: In een 1 liter fles 119.98g van natrium monobasisch oplossen in 1L steriele, DEPC behandeld H ₂ O. Bereid een 1M dibasisch oplossing in een 1L fles door het oplossen van 141.96g van dibasisch in 1L van steriele, DEPC behandeld H ₂ O. Combineer de mono-en di-oplossingen bij een verhouding van 1:1. Plaats kolf op een bord roer en meng met behulp van een magnetische roerstaaf. Pas de pH op 6,8 door toevoeging van natriumhydroxide (om de pH te verhogen) of fosforzuur (voor pH-daling).
2. 0.12M fosfaatbuffer: In een 500 ml kolf, een combinatie van 30ml 1M fosfaat-oplossing, pH 6,8, 2,5 ml van 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), en 5 ml van 0,5 M EDTA. Voeg steriele, DEPC behandeld H2O tot een volume van 225 ml. Pas de pH op 6,8. Voeg steriele, DEPC behandeld H2O tot 250ml. Autoclaaf.
3. 0.18M fosfaatbuffer: In een 500 ml kolf, een combinatie van 45 ml 1M fosfaat-oplossing, pH 6,8, 2,5 ml van 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), en 5 ml van 0,5 M EDTA. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot een volume van 225 ml. Pas de pH op 6,8. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot 250 ml. Autoclaaf.
4. 0,20 m fosfaatbuffer: In een 500 ml kolf, een combinatie van 50 ml 1M fosfaat-oplossing, pH 6,8, 2,5 ml van 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), en 5 ml van 0,5 M EDTA. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot een volume van 225 ml. Pas de pH op 6,8. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot 250 ml. Autoclaaf.
5. 0,40 M fosfaatbuffer: in een 500ml fles, combineer 100 ml 1M fosfaat-oplossing, pH 6,8, 2,5 ml van 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), en 5 ml van 0,5 M EDTA. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot een volume van 225 ml. Pas de pH op 6,8. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot 250 ml. Autoclaaf.
6. "1,00 m Fosfaat Buffer" (feitelijke concentratie van fosfaat in deze oplossing is 0,91 M): In een 500 ml kolf, een combinatie van 30ml 1M fosfaat Solution, pH6.8, 2,5 ml van 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), en 5 ml 0,5 M EDTA. Voeg steriele, DEPC behandeld H2O tot een volume van 225 ml. Pas de pH op 6,8. Voeg steriele, DEPC behandeld H ₂ O tot 250 ml. Autoclaaf.
7. Hydroxyapatiet hydratatie: Gewicht van 1g van hydroxyapatiet en toe te voegen aan een 50 ml buis. Voeg 6 ml van 0.12M fosfaatbuffer aan de hydroxyapatiet en omkeren om te mengen. Voorafgaand aan het gebruik brengen temperatuur tot 60 ° C en meng. Winkel voor langere tijd bij 4 ° C.
8. Voorafgaand aan het gebruik, evenwicht alle fosfaat buffers en gehydrateerd hydroxyapatiet bij 60 ° C.

2. Voorbereiding van de Econo-Column

1. Sluit kraan. Spoel column meerdere keren met gedemineraliseerd H ₂ O door herhaaldelijk om te keren de kolom en decanteren.
2. Haal de kraan van de Econo-kolom en de kolom autoclaaf te steriliseren.
3. Vervangen en sluit kraan. Voeg 1 ml van Sigmacote aan de steriele Econo-kolom en vacht alle glazen oppervlakken. Open de kraan en decanteren.
4. Bevestig kolom om een ​​circulerend waterbad en de ingestelde temperatuur tot 60 ° C. Om einsure de minste hoeveelheid warmteverlies over de kolom verpakking de kolom in een isolerend middel, zoals aluminiumfolie of schuim isolatie van de leidingen is aan te bevelen.
5. Twee keer Spoel de Econo-kolom met steriele, RNase-vrij H ₂ O vervolgens twee keer met een steriele, RNase-vrij 0.12M fosfaatbuffer.

3. Hydroxypaptite chromotografie

1. Ervoor zorgen dat de kraan gesloten is, langzaam 2 ml van de pre-en-klaar, geresuspendeerd hydroxyapatiet toe te voegen aan de onderkant van de Econo-kolom met behulp van een steriele 2ml serologische pipet.
2. Laat de hydroxyapatiet onder de kracht van de zwaartekracht te regelen voor 30 minuten.
3. Afvoer buffer uit kolom en sluit kraan. Combineer nucleïnezuren met 0.12M fosfaat buffer in een eindvolume van 500 pi en incuberen bij 60 ° C gedurende 10 minuten in een warmte-blok of waterbad.
4. Snel toe te passen nucleïnezuren bereid in 0.12M fosfaat buffer om het hydroxyapatiet met behulp van een 2ml serologische pipet en zorg ervoor dat u de kolom te verstoren.
5. Laat de nucleïnezuren te binden aan de hydroxyapatiet gedurende 30 minuten.
6. Plaats een 15 ml buis onder de kolom, opent de kraan en het verzamelen van de oorspronkelijke steekproef met ssDNA. Sluit kraan.
7. Voeg 6 ml van 0.12M fosfaatbuffer om het hydroxyapatiet en zorg ervoor dat u de kolom te verstoren, opent de kraan, en single-stranded DNA in de 15 ml buis van de vorige stap te verzamelen. Sluit kraan.
8. Voeg een volume van een fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:25:1 v / v / v) oplossing voor de buis, krachtig mix en centrifugeer bij 3500 xg gedurende 15 minuten. Overdracht supernatant met ssDNA om een ​​nieuw 15 ml buis.
9. Herhalen 3,76 en 3,87 met behulp van 6 ml van 0.20m fosfaatbuffer om eluit en te zuiveren RNA uit de kolom en zorg ervoor dat een nieuwe tube van 15 ml te gebruiken voor verzameling.
10. Herhalen 3,76 en 3,87 met behulp van 6 ml van 0,40 m fosfaatbuffer te elueren en het dsDNA zuiveren van de kolom en zorg ervoor dat een nieuwe tube van 15 ml te gebruiken voor verzameling.
11. Herhalen 3,76 en 3,87 met behulp van 6 ml van 1.00m fosfaat buffer op de kolom van de eventuele resterende dsDNA zorg ervoor dat u een nieuw 15ml tube te gebruiken ter incasso strip.

4. Ontzouten nucleïnezuurmonsters

1. Transfer 4-5 ml van het monster tot een Amicon Ultra-4 centrifugaal filter apparaat uitgerust met een 30.000 moleculair gewicht afgesneden Ultracel membraan.
2. Concentreer monster <500μl door het draaien bij 6000 xg, 30 ° C, 5 minuten (of tot geconcentreerde volume is bereikt) in een vaste hoek rotor. Gooi doorstromen.
3. Voeg de rest van het monster (s) om de Amicon Ultra-4 centrifugaal filter apparaat en breng het volume tot 4-5 ml met RNase vrij 1X TE-buffer.
4. Concentreer monster <500μl door het draaien bij 6000 xg, 30 ° C, 5 minuten (of tot geconcentreerde volume is bereikt) in een vaste hoek rotor. Gooi doorstromen.
5. Voeg 4-5 ml RNase vrij 1X TE-buffer om de Amicon Ultra-4 centrifugaal filter apparaat. Concentreer monster <500μl door centrifugeren bij 6000 xg, 30 ° C, 5 minuten (of tot geconcentreerde volume is bereikt) in een vaste hoek rotor. Gooi doorstromen.
6. Herhaal stap 4.5 een extra 5 keer volledig te ontzouten nucleïnezuurmonster (s).
7. Transfer resterende monster (s) op een steriele 1.7ml eppendorfbuisje. Voeg 1/10e volume 3M natriumacetaat, pH 7,0, twee volumes van 100% ethanol, en 1μl van Glycoblue. Meng goed door vortexen.
8. Centrifugeer op 28000 xg, 4 ° C, 60 minuten. Decanteren en zorg ervoor dat u de pellet te verstoren. Voeg 300μl van 70% ethanol. Draaien op 28.000 xg, kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Decanteren, droog en resuspendeer elke fractie in een geschikt volume van de RNAse-vrij TE-buffer.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1 geeft een overzicht van de methoden gepresenteerd voor het gebruik van hydroxyapatiet chromatografie te fractioneren ssDNA, dsDNA en RNA nucleïnezuren uit een gemengd virale assemblage. Deze methode maakt gebruik van de lading interactie tussen de negatief geladen fosfaat ruggengraat van de nucleïnezuren en de positief geladen Ca ^{2 +} ionen in het hydroxyapatiet en zorgt voor de efficiënte fractionering van nucleïnezuur subtypes (ssDNA, dsDNA en RNA) met toenemende concentraties fosfaat buffer ^12.

De hydroxyapatiet fractionering van een in vitro "community" van bekende ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) en RNA (MS2 en phi6) virale genomen wordt geïllustreerd in Figuur 2. De nucleïnezuren werden gecombineerd in gelijke concentraties, toegepast op het hydroxyapatiet kolom en werden geëlueerd met behulp van een toenemende concentratie van fosfaat buffer. Elk nucleïnezuur subtype elueert onafhankelijk van de anderen met minder dan 9% van de ene fractie over te hevelen naar de volgende.

De toepassing van deze techniek om nucleïnezuren geïsoleerd van een virale gemeenschap verzameld uit de Chesapeake Bay is weergegeven in figuur 3. De totale opbrengst nucleïnezuur geïsoleerd uit gezuiverde virussen werd toegepast op de hydroxyapatiet kolom. Genomisch materiaal dat bestaat uit ssDNA, RNA en dsDNA werd onafhankelijk geëlueerd met 0.12M, 0.20m en 0.40M/1.00M concentraties van fosfaat buffer respectievelijk. Dubbelstrengs DNA wordt geëlueerd bij fosfaat concentraties van 0,40 m en 1,00 m en in dit geval, domineert deze virale gemeenschap ten opzichte van ssDNA en RNA genotypen. Deze waarneming is in overeenstemming met de verwachte virale gemeenschap samenstelling van de mariene en estuariene omgevingen waar de meerderheid van de realiseerbare nucleïnezuren zijn dsDNA ^13.

Figuur 1. Stroomdiagram van het hydroxyapatiet chromatografie methode voor de fractionering van nucleïnezuren. Een mengsel van ssDNA, dsDNA en RNA bereid in 0.12M fosfaatbuffer wordt verwarmd tot 60 ° C en toegepast op een hydroxyapatiet kolom op een constante 60 ° C met behulp van een circulerend waterbad. Nucleïnezuren (ssDNA, RNA en dsDNA) zijn geëlueerd van het hydroxyapatiet met toenemende concentraties van een fosfaat-bevattende buffer. Dit cijfer is overgenomen met toestemming van de American Society of Microbiology en was oorspronkelijk te zien in Andrews-Pfannkoch et al.. 2010 ^12.

Figuur 2. Scheiding van bekende virale nucleïnezuren met behulp van hydroxyapatiet chromatografie. Gelijke concentraties van M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA en lambda dsDNA (lanen 2-5, respectievelijk) werden gecombineerd (baan 6) en toegepast op een hydroxyapatiet kolom. Single-stranded DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) en dsDNA (lambda) werden onafhankelijk geëlueerd van het hydroxyapatiet kolom met behulp van 0.12M (laan 8), 0.18M (laan 9) en 0.40M/1.00M (baan 10) . Een 1kb ladder (lanen 1, 7) werd gebruikt om genoom maten te bevestigen. Dit cijfer is overgenomen met toestemming van de American Society of Microbiology en was oorspronkelijk te zien in Andrews-Pfannkoch et al.. 2010 ^12.

Figuur 3. Scheiding van virale nucleïnezuren geïsoleerd uit een gemeenschap binnen de Chesapeake Bay. Nucleïnezuren werden geïsoleerd en toegepast op een hydroxyapatiet kolom. ssDNA (laan 0.12M), RNA (laan 0.20m) en dsDNA (lanen 0.40M/1.0M) werden onafhankelijk van elkaar geëlueerd met behulp van fosfaat-buffer concentraties van 0.12M, 0.20m en 0.40M/1.00M, respectievelijk. Hi Mass DNA Ladder (laan L1) en 1kb Ladder (laan L2) werden gebruikt om visueel te bevestigen benaderde moleculaire gewicht en de massa van nucleïnezuren. Dit cijfer is overgenomen met toestemming van de American Society of Microbiology en was oorspronkelijk te zien in Andrews-Pfannkoch et al.. 2010 ^12.

De hydroxyapatiet chromatografie methodiek hier wordt gepresenteerd is een zeer efficiënte en robuuste hulpmiddel voor de fractionering van nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages, wanneer het doel is het bestuderen van de totale nucleïnezuur samenstelling van de gemeenschap. In het algemeen zal ssDNA, RNA en dsDNA elueren uit de kolom pho fosfaatbuffer concentraties hoger dan ongeveer ~ 0en 0,40 m respectievelijk. Echter, elke bereiding van hydroxyapatiet hebben een iets andere samenstelling en elutieprofiel dus is het belangrijk om te testen elke bereiding met behulp van bekende nucleïnezuren (bijv. van een gecultiveerde virus voorbereiding). Hierdoor kan de gebruiker de specifieke concentraties van fosfaat-bevattende buffers nodig om de gewenste nucleïnezuren elueren vast te stellen.

Een beperkende factor van deze techniek is de hoeveelheid beschikbare Ca ^{2 +} ionen in het hydroxyapatiet dat het fosfaat ruggengraat van de nucleïnezuren kan binden. De capacityamount van het hydroxyapatiet in de kolom kan worden opgeschaald omhoog of omlaag om kolom (bepaald door de grootte van de watermantel kolom en de hoeveelheid van de gebruikte hydroxyapatiet) en het volume van de buffers gebruikt voor elutie kan worden opgeschaald naar boven of beneden om tegemoet zeer kleine of zeer grote hoeveelheden van de input nucleïnezuren, maar wordt uiteindelijk beperkt door de grootte van het water-mantel kolom.

Bovendien, een partij techniek waarbij de nucleïnezuren, hydroxyapatiet, en fosfaat-bevattende buffers worden gecombineerd in een buis, gemengd en gecentrifugeerd bij lage snelheid is een alternatieve manier van isoleren gerichte nucleïnezuren. Deze strategie kan gunstig zijn in sommige gevallen, maar is niet zo betrouwbaar als de chromatografische methoden die zijn nauwkeuriger en betere fractionering van nucleïnezuren.