定量分析和HO -核酸内切酶的形成，刺激单链退火染色体易位酿酒酵母

Lauren Liddell^1,2, Glenn Manthey², Nicholas Pannunzio³, Adam Bailis²

¹Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, ²Department of Molecular and Cellular Biology, City of Hope Comprehensive Cancer Center and Beckman Research Institute, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California, Norris Comprehensive Cancer Center

1。何刺激的易位频率

1. 10-20独立YPGly / LAC培养基（1％酵母提取物，2％蛋白胨，3％甘油和3％乳酸）1毫升的文化所需的基因型的单菌落接种。足够的时间达到了约5X10 ⁷ - 1 × 10 ⁸细胞/ ml的细胞密度，在30 ° C的肩，或轻轻摇动孵育过夜，或文化。
2. 添加半乳糖的文化终浓度为2％，以诱使何内切酶的定向双链断裂的HIS3 -Δ3“（第三号染色体） 和HIS3Δ5”（第十五号染色体）易位基板。
3. 孵育30 ° C的肩，轻轻摇动或4小时。
4. 4 h后，板适当稀释到YPD（酵母提取物1％，2％蛋白胨，2％葡萄糖）的文化产生每盘约100至200个菌落，并到中型组氨酸缺乏足够数量的细胞产生可观察到的他的重组菌落数。孵育板在30 ° C为两到三天。

注：1.4步介绍易位频率选择性的条件下镀上的文化中缺乏组氨酸的决心。此法可非选择性的条件下也可进行电镀到YPD文化，然后复制电镀到他板两到三天后出现的殖民地。这些方法产生类似的易位频率（ 图2C）。

5. 易位的频率来确定的组氨酸prototrophic菌落数除以镀活菌总数（上YPD电镀稀释确定）。确定中位数的易位频率和95％的置信^区间 15 。

2。电镀效率

1. 每个过夜培养的细胞中取出等份，并确定由hemacytometer计数（百特医疗用品公司Catolog＃：B3178 - 1）的细胞数。
2. 约100至200个细胞，用适当稀释到YPD板。孵育两到三天，在30 ° C（如用1 × ¹⁰ 8细胞/ ml的细胞密度的文化，应板100-200 10-5稀释每板液）。
3. 添加20％的半乳糖终浓度为2％的文化。
4. 4小时后，取出细胞从每一种文化等分，确定hemacytometer计数细胞数，板约100至200个细胞，用适当稀释到YPD。两到三天的孵育30 ° C。
5. 确定出现细胞镀上YPD的殖民地，这个商数乘以100除以电镀效率。确定95％的置信区间中位数的百分比。

3。基因组南方杂交分析

1. 选择一个单一的他⁺每个独立审判的重组殖民地和准备的基因组^DNA 16 。
2. 用BamHI限制性内切酶消化约4微克的DNA。
3. 独立的酶BamHI酶切片段在0.7％琼脂糖凝胶，并转移到一个带正电荷的尼龙膜（Hybond N ^+，通用电气保健产品代码^{：RPN303B）17。}
4. 一个P - ³²标记的探针与随机引物（Amersham Biosciences公司产品编号：RPN1604）获得一个1.8 kb的酶BamHI / BamHI酶切基因组含有HIS3基因的克隆与杂交。
5. 可视化放射自显影或磷光的DNA片段。

4。染色体杂交分析使用分离的染色体轮廓钳位均匀电场（厨师）：

1. 准备从选中他的琼脂糖插头^{18 +}重组体的染色体：
   • 液体培养长出了他^的 +候选人TXV：III染色体含有重组在5毫升YPD，约1-2 x ¹⁰ 8细胞/毫升。
   • 降速和50毫米EDTA洗细胞2次。
   • 悬浮细胞，在约200μL50 mM的EDTA，和温暖至50 ° C。
   • 新增的熔融等体积的2％（W ​​/ V），低熔点琼脂糖带来至50℃，调匀。
   • 免除到插头模具约80μL分装，并让他们冷却30分钟，在4 ° C。
   • 拉伸从模具中插入一个12孔的菜。每口井可放入多达五个插头。
   • 加入3毫升新鲜配制的spheroplasting解决方案（2 -β-巯基乙醇14毫米，20毫米EDTA，0.5毫克/毫升Zymolyase 20T，10毫米的Tris - HCl，pH值7.5，1米山梨醇），每孔。在37 ° C孵育4小时，轻轻摇动。
   • 删除spheroplasting的解决方案，并取代LDS的解决方案（3毫升10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，100毫米EDTA，1％（W / V）十二烷基硫酸钠锂，adjus吨pH值至8.0）。在37 ° C下15分钟，轻轻摇动。
   • 删除LDS的解决方案，并取代另一个LDS 3毫升分装。在37 ° C过夜，轻轻摇动。
   • 删除LDS和与NDS（5克的N -月桂酰肌氨酸，93克二钠EDTA二水，0.6克Tris碱，调节pH值至8.0，与卫生署₂ 500毫升）0.2 × 3毫升取代。在室温下孵育30分钟，轻轻摇动。删除NDS和重复2次。
   • 删除NDS和替换3毫升TE。在室温下30分钟洗净，轻轻摇动。重复4次。
   • 商店插头在4 ° C在2毫升的TE。插头可以保留最多的一年。
2. 独立的染色体上的1％琼脂糖凝胶，用一个Bio - Rad公司的厨师DRII仪器在14 ° C（产品编号：170-3612）。

参数： ^第一座：70年代的开关时间，6V/cm 15H 。
^第二块：120S开关时间，在6V/cm 11H

3. 可视化染色与1μg/ml溴化乙锭为30分钟，60兆焦耳的紫外线照射在紫外线Stratalinker（Stratagene公司）的染色体，染色30分钟_{DH 2} O辐照溴化乙锭染色染色体缺口的DNA，以便有效地转移到细胞膜。
4. 染色体转移到一个带正电的膜（Hybond N + GE医疗产品编号：RPN303B。）在变性条件下的毛细作用（0.4N的NaOH，1.5M氯化钠）。
5. 杂交与一个³² P标记探针与随机引物（Amersham Biosciences公司产品编号：RPN1604）获得了1.8 kb的酶BamHI / BamHI酶切基因组含有 HIS3 ^基因 17的克隆。
6. 可视化放射自显影或磷光染色体。

5。代表性的成果：

描绘在染色体水平（ 图1）易位检测的一个图形表示。实验过程的示意图还显示（ 图2A） 。前和上岗后的电镀效率是可行的，集落形成细胞总数除以总数由胞体在hemacytometer计数（图4B）所确定的文化决定的。前和上岗后电镀效率没有显着不同的野生型细胞（p值= 0.1400）（ 表1）。

表1。前和在野生型细胞诱导后的电镀效率 。

hemacytometer计数^的每毫升细胞机构的数量确定。
^b的每毫升的活菌数是由非选择性培养基上镀适当稀释，产生约100-200殖民地。
^C的前和诱导后的电镀效率除以总数的决定可行的，集落形成，细胞总数hemacytometer数确定，胞体在文化。

这表明，两种易位染色体的存在或不存在不影响生存的能力DSB的形成。染色体易位的频率可以计算出电镀到YPD（ 图2B）确定的活菌总数除以组氨酸prototrophic殖民地。此法可使用不同基因型的菌株，以确定蛋白质的功能丧失如何影响SSA（即^{rad51Δ - / - ）}进行。然后，可以绘制在不同菌株中确定的重组频率比较这些菌株的公共福利金（图2C）HO -内切酶诱导双链断裂的修复能力的差异。下选择性的野生型二倍体株^{（2.2x10 -2）}和非选择性^{（2.17x10 -2）}的条件下获得的易位频率在统计学上没有不同，从对方（p值= 0.9131），而易位的频率选择性地获得（6.0x10 ^-2）和非选择性（11.9x10 ^-2）与rad51Δ ^{- / -}纯合子相似，但统计学差异（p值= 0.0089） 。获得的频率选择性（p值= 0.0001）和非选择性（p值= 0.0002）与RAD51 ° ^{- / -}纯合子有统计学使用相应的条件，与野生型菌株获得的不同。

假定易位轴承克隆可进一步研究基因组Southern杂交和染色体杂交分析（ 图3）。南部分析，基因组DNA琼脂糖凝胶电泳前用BamHI内切酶消化，杂交和杂交³²P标记1.8kb HIS3探头可视化诊断0.8 KBhis3Δ200，1.7 kb的HIS3 -Δ3“，4 KB tIII：第十五5 KB TXV：第三，和8 KB HIS3 -Δ5”片段（ 图3B.1） 。可以编制完整的染色体，由厨师（ 图3B.2）分隔，抹杀尼龙和^32个杂交标记的P - 1.8 KB HIS3探头可视化1.1 MB第十五完整的染色体，0.8 MB TXV：三易位染色体，0.6 MB tIII：第十五易位染色体，0.3 MB，完整的染色体三（图 3B.3） 。一个图形化的地图描绘预计酶BamHI内切酶消化基因组DNA片段，以及家长和重组的染色体，是描绘（ 图3A） 。

图1。易位染色体形成单链退火（SSA），1）双链断裂的HIS3Δ3和HIS3 -Δ5“基板何内切酶（染色体十五和第三，分别）创建下面的另外半乳糖文化。 2）DSB的处理，生成破碎的染色体末端的3'单链。 3）SSA机械退火互补311或60核苷酸的单链 HIS3重组基板形成序列。经退火形成的非同源的尾巴是由内切酶消化中删除。互补四个BP出挑何酶切形成的，其余的染色体片段也可退火。 4）结扎总结创造一个完整的基因HIS3和TXV：SSA三，易位染色体。携带此染色体的细胞，可以选择为他们的成长中缺乏组氨酸的能力。结扎也可能会产生互惠tIII：第十五易位染色体由一个NHEJ类似机制。

图2。确定SSA易位的频率含量 。）毫升YPGly / LAC文化是一个选择基因型的细胞单菌落接种，并成长为一个适当的^密度约5X10 7 - ¹ × 10 8细胞/毫升。半乳糖添加到终浓度2％，第三和第十五号染色体上的重组基板，以创建双链断裂。要选择性的条件下进行检测，适当稀释液等，约100到200个细胞镀到YPD和足够数量的细胞中缺乏组氨酸镀上产生一个观察到他的重组菌落数。无选择的进行检测，大约100到200个细胞接种到YPD，种植两到三天，以单菌落，然后到中期缺乏组氨酸的副本镀。二）易位频率可确定的殖民地，在他的板增长的比例增长YPD数量除以。 C）株不同基因型（ 即野生型和rad51Δ易位频率^{- / - ）}可以绘制比较这些菌株的公共福利金的双链断裂的修复能力的差异。

图3。确定电镀效率 （一）等分是从过夜培养前和后DSB诱导的细胞，适当稀释，由hemacytometer计数，以确定细胞每毫升文化机构的总数。镀到非选择性培养基，以确定适当的稀释总数每毫升的活菌计数菌落出现在YPD。 （二）电镀效率，然后由细胞体的总数除以活菌总数，并乘以100这个商数确定。

图4。检测基因组Southern杂交和染色体杂交分析染色体易位的事件 。
一）有关染色体的图形表示前（左）后（右）易位形成 。
家长和重组染色体的大小列出megabase对（MB）。包含从父和重组菌株的基因组DNA经BamHI消化所产生的相关序列的限制片段的大小，以及一个1.8 kb的BamHI位HIS3基因组克隆杂交印迹显示，在碱基对（KB）上市。染色体是不是按比例绘制。
二）物理分析公认的易位轴承克隆。
（1）基因组Southern杂交分析 - 收集和基因组DNA用BamHI限制性内切酶消化，电泳，BLO分馏拟合尼龙，和一个P -标记³² 1.8 kb的HIS3探针杂交，以可视化下面的片段 ：his3Δ200KB 0.8，1.7 kb的HIS3Δ3“，4 KB tIII：第十五5 KB TXV：：三， 8 KB HIS3 -Δ5“。车道：）的母公司二倍体，B） ^他+非相互易位重组，C） ^他 +相互易位重组。
（2）厨师凝胶 - 完整的染色体制备琼脂糖插头，由厨师分离，溴化乙锭染色，紫外光下可视化。车道：如上。
（3）染色体印迹-分离染色体涂抹尼龙和标记的P - ³² 1.8 kb的HIS3探针杂交可视染色体：1.1 MB，0.8 MB TXV完整的染色体十五：三易位染色体，0.6 MB tIII：第十五易位染色体，0.3 MB完整的染色体三。车道：如上。