The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 2Department of Molecular and Cellular Biology, City of Hope Comprehensive Cancer Center and Beckman Research Institute, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California, Norris Comprehensive Cancer Center
Liddell, L., Manthey, G., Pannunzio, N., Bailis, A. Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (55), e3150, doi:10.3791/3150 (2011).
1. हो उत्तेजित स्थानान्तरण आवृत्तियों
नोट: 1.4 चरण चयनात्मक शर्तों के तहत मध्यम कमी हिस्टडीन पर चढ़ाना संस्कृतियों के द्वारा स्थानान्तरण आवृत्तियों के दृढ़ संकल्प का वर्णन है. इस परख भी YPD पर चढ़ाना संस्कृतियों के द्वारा कर सकते हैं गैर चयनात्मक शर्तों के तहत आयोजित किया जाना है, और फिर प्रतिकृति चढ़ाना कालोनियों है कि प्लेटों - उनकी पर दो से तीन दिनों के बाद पैदा होती है. इन विधियों स्थानान्तरण के समान आवृत्तियों (चित्रा 2C) का उत्पादन.
2. चढ़ाना क्षमता
3. जीनोमिक दक्षिणी धब्बा विश्लेषण
4. क्रोमोजोम में अलग क्रोमोसोम का उपयोग कर धब्बा विश्लेषण एक समोच्च clamped सजातीय बिजली के क्षेत्र (CHEF):
1 सेंट ब्लॉक: 70 स्विच समय, 6V/cm पर 15h पैरामीटर.
2 एन डी ब्लॉक: 120s स्विच समय, 6V/cm पर 11h
5. प्रतिनिधि परिणाम:
स्थानान्तरण परख की एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व गुणसूत्र स्तर (चित्रा 1) में दिखाया गया है. प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध भी प्रदर्शित किया जाता है (2A चित्रा). दोनों पूर्व और पोस्ट प्रेरण चढ़ाना क्षमता hemacytometer गिनती (4B चित्रा) के द्वारा निर्धारित संस्कृति में सेल निकायों की कुल संख्या से व्यवहार्य, कॉलोनी बनाने कोशिकाओं की कुल संख्या को विभाजित करके निर्धारित कर रहे हैं. पूर्व और बाद प्रेरण चढ़ाना क्षमता काफी जंगली प्रकार कोशिकाओं (पी मूल्य = 0.1400) (तालिका 1) के लिए अलग नहीं थे .
तालिका 1. पूर्व और बाद प्रेरण जंगली प्रकार की कोशिकाओं में चढ़ाना क्षमता .
मिली लीटर प्रति सेल निकायों की संख्या hemacytometer गिनती से निर्धारित होते हैं.
मिली लीटर प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गैर चयनात्मक माध्यम पर उपयुक्त dilutions चढ़ाना ~ 100-200 कालोनियों का उत्पादन द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.
ग पूर्व और बाद प्रेरण चढ़ाना क्षमता की कुल संख्या को विभाजित करके निर्धारित किया जाता है व्यवहार्य, कॉलोनी के गठन, संस्कृति में सेल निकायों, hemacytometer गिनती द्वारा निर्धारित की कुल संख्या से कोशिकाओं .
यह पता चलता है कि या तो स्थानान्तरण गुणसूत्र की उपस्थिति या अनुपस्थिति DSB गठन जीवित रहने की क्षमता को प्रभावित नहीं करता है. गुणसूत्र translocations की आवृत्ति हिस्टडीन prototrophic कालोनियों की संख्या व्यवहार्य YPD पर चढ़ाना (चित्रा 2B) द्वारा निर्धारित कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित करके गणना की जा सकती है . (/ - यानी rad51Δ) यह परख अलग जीनोटाइप के उपभेदों का उपयोग कैसे प्रोटीन समारोह के नुकसान के सर्व शिक्षा अभियान को प्रभावित करता है की पहचान आयोजित किया जा सकता है. पुनर्संयोजन अलग अलग उपभेदों में निर्धारित आवृत्तियों तो इन उपभेदों की क्षमता को सर्व शिक्षा अभियान (चित्रा 2C) के द्वारा हो - endonuclease प्रेरित DSBs की मरम्मत में मतभेदों की तुलना करने के लिए रेखांकन किया जा सकता है. स्थानान्तरण चयनात्मक के तहत जंगली प्रकार द्विगुणित तनाव (-2 2.2x10) और (-2 2.17x10) गैर चयनात्मक शर्तों के साथ प्राप्त आवृत्तियों सांख्यिकीय एक दूसरे को (पी मूल्य = 0.9131) से अलग नहीं थे, जबकि स्थानान्तरण आवृत्तियों चुनिंदा प्राप्त (6.0x10 -2) और (-2 11.9x10) गैर चुनिंदा rad51Δ के साथ - / - homozygote समान है लेकिन सांख्यिकीय अलग (पी मूल्य = 0.0089) थे. / - - आवृत्तियों rad51 ° के साथ चुनिंदा दोनों (पी मान = .०००१) और गैर चुनिंदा (पी मूल्य = 0.0002) प्राप्त homozygote सांख्यिकीय प्राप्त उन जंगली प्रकार के तनाव के साथ संगत शर्तों का उपयोग कर से अलग थे.
ख्यात स्थानान्तरण असर क्लोन आगे जीनोमिक दक्षिणी धब्बा और गुणसूत्र धब्बा विश्लेषण (चित्रा 3) के द्वारा जांच की जा सकती है. दक्षिणी विश्लेषण के लिए, जीनोमिक डीएनए BamHI agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पहले endonuclease के साथ पचता है, सोख्ता और 32 एक संकरणटुकड़े 1.8kb (3B.1 चित्रा) HIS3 जांच नैदानिक 0.8 केबी his3Δ200, 1.7 केबी his3 Δ3 ':: XV, 5 केबी tXV: III, और 8 his3 - Δ5 केबी, 4 केबी tIII कल्पना करने के लिए पी - लेबल . बरकरार गुणसूत्रों, तैयार किया जा सकता है CHEF (3B.2 चित्रा) द्वारा अलग नायलॉन blotted और 32 के साथ संकरित पी लेबल 1.8 केबी HIS3 जांच 1.1 एमबी बरकरार गुणसूत्र XV, 0.8 Mb tXV कल्पना करने के लिए: क्ष्क्ष्क्ष् स्थानान्तरण गुणसूत्र, 0.6 एमबी tIII: XV स्थानान्तरण गुणसूत्र, और 0.3 एमबी बरकरार गुणसूत्र III (3B.3 चित्रा). एक चित्रमय नक्शा उम्मीद चित्रण BamHI endonuclease पचा जीनोमिक डीएनए टुकड़े, और माता पिता और पुनः संयोजक गुणसूत्रों (चित्रा 3A) दिखाया गया है.
चित्रा 1. स्थानान्तरण गुणसूत्रों की एकल भूग्रस्त द्वारा संरचना (एसएसए) annealing 1.) DSBs his3 Δ3 'और his3 Δ5' substrates हो endonuclease द्वारा (क्रोमोसोम XV और तृतीय, क्रमशः) पर संस्कृतियों के लिए galactose के अलावा के बाद बनाई गई हैं . 2) DSBs टूटी क्रोमोसोम के सिरों पर 3 'एकल किस्में उत्पन्न संसाधित कर रहे हैं. 3) सर्व शिक्षा अभियान मशीनरी 311 पूरक या 60 nucleotide एकल असहाय HIS3 पुनर्संयोजन substrates के प्रत्येक पर गठित दृश्यों anneals. गैर मुताबिक़ annealing पर गठन पूंछ endonuclease पाचन द्वारा हटा रहे हैं. पूरक चार बीपी overhangs शेष गुणसूत्र हो - endonuclease पाचन द्वारा गठित टुकड़े पर पानी रखना भी हो सकता है. सर्व शिक्षा अभियान द्वारा III गुणसूत्र स्थानान्तरण:) 4 Ligation एक अक्षुण्ण HIS3 जीन और tXV के निर्माण निष्कर्ष निकाला है. इस गुणसूत्र ले जाने कक्ष उनके मध्यम कमी हिस्टडीन पर विकसित करने की क्षमता के द्वारा के लिए चुना जा सकता है है. : Ligation XV NHEJ की तरह एक तंत्र द्वारा गुणसूत्र स्थानान्तरण: भी पारस्परिक tIII उत्पन्न कर सकते हैं.
चित्रा 2. सर्व शिक्षा अभियान द्वारा स्थानान्तरण की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए परख ए) एक मिलीलीटर / YPGly लाख संस्कृतियों एक का चयन जीनोटाइप की कोशिकाओं के एकल कालोनियों के साथ inoculated हैं और 5x10 लगभग 7 1x10 सेल मिलीलीटर / 8 के एक उचित घनत्व हो गई . Galactose 2% की एक अंतिम एकाग्रता गुणसूत्रों III और XV पर पुनर्संयोजन substrates पर DSBs बनाने के लिए जोड़ा है. चयनात्मक शर्तों के तहत परख आचरण करने के लिए, उपयुक्त dilutions ऐसे बना रहे हैं कि लगभग 100 से 200 कोशिकाओं YPD पर चढ़ाया जाता है और कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या में मध्यम कमी हिस्टडीन पर चढ़ाया जाता है उसकी + पुनः संयोजक कालोनियों के एक नमूदार संख्या उपज. चयन के बिना परख आचरण करने के लिए, लगभग 100 से 200 कोशिकाओं YPD पर चढ़ाया जाता है, एकल और फिर कालोनियों प्रतिकृति मध्यम कमी हिस्टडीन पर मढ़वाया दो से तीन दिनों के लिए हो. बी) स्थानान्तरण आवृत्ति है कि अंश कि YPD बढ़ने पर पर उनके प्लेटों बढ़ने कालोनियों की संख्या को विभाजित करके निर्धारित किया जा सकता है. सी) अलग जीनोटाइप (यानी जंगली प्रकार और rad51Δ के उपभेदों के स्थानान्तरण आवृत्तियों - / -) के लिए इन उपभेदों की क्षमता करने के लिए सर्व शिक्षा अभियान द्वारा DSBs मरम्मत में मतभेदों की तुलना करने के लिए रेखांकन किया जा सकता है.
चित्रा 3. चढ़ाना दक्षता निर्धारण (ए) कोशिकाओं का एक विभाज्य पहले रातोंरात संस्कृति और पोस्ट DSB प्रेरण से लिया जाता है. उपयुक्त dilutions की एक hemacytometer गिनती से पीछा कर रहे हैं संस्कृति के मिलीलीटर प्रति सेल निकायों की कुल संख्या का निर्धारण. उपयुक्त dilutions गैर चयनात्मक माध्यम पर चढ़ाया जाता है कि YPD पर प्रकट होने वाली कालोनियों की गिनती के द्वारा, मिलीलीटर प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण. (बी) चढ़ाना दक्षता तो सेल निकायों की कुल संख्या से व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या में विभाजित है, और इस भागफल 100 से गुणा करके निर्धारित किया जाता है.
चित्रा 4. जीनोमिक दक्षिणी धब्बा और गुणसूत्र धब्बा विश्लेषण द्वारा गुणसूत्र स्थानान्तरण घटनाओं की जांच.
ए) प्रासंगिक क्रोमोसोम के ग्राफ़िकल पहले प्रतिनिधित्व (बाएं) और (दाएं) स्थानान्तरण के गठन के बाद.
माता - पिता और पुनर्योगज गुणसूत्रों के आकार megabase जोड़े (एमबी) में सूचीबद्ध हैं. प्रतिबंध प्रासंगिक माता पिता और पुनः संयोजक उपभेदों से जीनोमिक डीएनए के BamHI पाचन द्वारा उत्पन्न दृश्यों युक्त टुकड़े के आकार, और एक 1.8 केबी BamHI HIS3 जीनोमिक क्लोन के साथ संकरण द्वारा blots पर पता चला, kilobase जोड़े (केबी) में सूचीबद्ध हैं . गुणसूत्रों पैमाने पर करने के लिए तैयार नहीं हैं.
बी) के ख्यात स्थानान्तरण असर क्लोन की शारीरिक विश्लेषण.
(1) जीनोमिक दक्षिणी धब्बा विश्लेषण जीनोमिक डीएनए और एकत्र पचा BamHI प्रतिबंध endonuclease के साथ किया गया था, जेल वैद्युतकणसंचलन, blo द्वारा fractionatedनायलॉन tted है, और एक 32 पी लेबल 1.8 केबी HIS3 जांच संकरित निम्नलिखित टुकड़े कल्पना: 0.8 केबी his3Δ200, 1.7 केबी his3 - Δ3, 4 केबी tIII: XV, 5 केबी tXV: III, और 8 केबी his3 Δ5 '. लेन: एक) माता पिता द्विगुणित, ख) + गैर पारस्परिक रीकॉम्बीनैंट स्थानान्तरण, ग) उनकी + पारस्परिक रीकॉम्बीनैंट स्थानान्तरण.
(2) CHEF जैल - बरकरार गुणसूत्रों agarose प्लग में तैयार थे, CHEF द्वारा अलग ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग और पराबैंगनी प्रकाश के तहत कल्पना. जैसा कि ऊपर: लेन.
(3) क्रोमोजोम blots - अलग क्रोमोसोम नायलॉन blotted थे और 32 पी लेबल 1.8 केबी HIS3 जांच के साथ संकरित निम्नलिखित गुणसूत्रों कल्पना: 1.1 एमबी बरकरार गुणसूत्र XV, 0.8 Mb tXV: क्ष्क्ष्क्ष् स्थानान्तरण गुणसूत्र, 0.6 Mb tIII: XV स्थानान्तरण गुणसूत्र, और 0.3 Mb बरकरार गुणसूत्र III. जैसा कि ऊपर: लेन.
विकिरण की उच्च खुराक 19 DSBs की एक बड़ी संख्या की पीढ़ी के माध्यम से जीनोम अस्थिरता का एक अंतर्निहित जोखिम उपस्थित थे. यूकेरियोटिक जीनोम दोहराव दृश्यों कि translocations और अन्य जीनोमिक rearrangements 20,21 पैदा करने के लिए उत्कृष्ट substrates से परिपूर्ण हैं. मानव संसाधन द्वारा गुणसूत्र translocations अक्सर जब DSBs दोहराव 12,21,22 दृश्यों के बीच पेश कर रहे हैं मनाया जाता है. भारी सबूत है कि ल्यूकेमिया और lymphomas गुणसूत्र translocations के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है के साथ जुड़े जीनोमिक अस्थिरता के बहुत है, समझ कैसे इस तंत्र 22,23 eukaryotes में होता है के महत्व पर प्रकाश डाला पता चलता है. हम नवोदित खमीर में अलग क्रोमोसोम है कि आकार में दोहराव खमीर और मानव जीनोम भर में छितरी हुई तत्वों समान हैं पर अनुरूपता की कमी क्षेत्रों के बीच DSB प्रेरित मानव संसाधन द्वारा स्थानान्तरण क्रोमोसोम के गठन की जांच के लिए एक प्रणाली विकसित की है.
परख में, 'his3 - Δ3 स्थानान्तरण सब्सट्रेट गुणसूत्र XV की एक प्रति पर स्थित है. अन्य his3 एलील (his3 Δ200) एक ~ HIS3 प्रमोटर और कोडन अनुक्रम कि 24 की मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा से इस अनुक्रम रोकता के 1kb विलोपन है. 'his3 - Δ5 सब्सट्रेट गुणसूत्र III की एक प्रति पर LEU2 लोकस में स्थित है, अन्य गुणसूत्र क्ष्क्ष्क्ष् के प्रति एक अनछुए LEU2 एलील (चित्रा 1) से युक्त के साथ. एक galactose-inducible हो endonuclease अभिव्यक्ति KAN - एमएक्स के साथ चिह्नित कैसेट गुणसूत्र चतुर्थ (: लड़की हो - KAN - एमएक्स trp1) के TRP1 बिन्दुपथ में डाला गया था. प्रत्येक स्थानान्तरण सब्सट्रेट मान्यता हो endonuclease अनुक्रम कि दरार के लिए galactose के माध्यम के अलावा के माध्यम से एचओ जीन की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण द्वारा लक्षित किया जा सकता द्वारा flanked है. हो - endonuclease his3 Δ3 'और his3 - Δ5' substrates पर प्रेरित दरार के बाद, कोशिकाओं कुशलतापूर्वक HIS3 अनुक्रम समरूपता के साझा लघु पथ (311 बीपी या बीपी 60) का उपयोग करने के लिए मानव संसाधन से टूट गुणसूत्रों की मरम्मत कर सकते हैं, एक स्थानान्तरण गुणसूत्र पैदा एक अक्षुण्ण HIS3 12-14,25 एलील के साथ .
क्योंकि माता पिता कोशिकाओं HIS3 जीन की एक अक्षुण्ण प्रतिलिपि की कमी है, वे पर - उनके माध्यम विकसित करने में असमर्थ हैं. केवल कोशिकाओं है कि स्थानान्तरण घटना आया है मध्यम कमी हिस्टडीन पर के लिए चयनित किया जा सकता है है. इसलिए, गुणसूत्र translocations की आवृत्ति हिस्टडीन prototrophic कालोनियों की संख्या व्यवहार्य मढ़वाया कोशिकाओं, YPD पर चढ़ाना द्वारा निर्धारित की कुल संख्या से विभाजित करके गणना की जा सकती है. जीनोमिक डीएनए और बरकरार गुणसूत्रों तो प्रतिनिधि उनकी + कालोनियों, और एक स्थानान्तरण जीनोमिक दक्षिणी और गुणसूत्र धब्बा विश्लेषण द्वारा सत्यापित गुणसूत्र की उपस्थिति से अलग किया जा सकता है .
सावधानी से विश्लेषण हमें की अनुमति दी गई है 12 परख के बारे में अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी इकट्ठा. जीनोमिक दक्षिणी धब्बा विश्लेषण सबूत है कि वहाँ गुणसूत्रों XV और तृतीय हो - endonuclease प्रेरण के 30 मिनट के बाद लगभग पूरा काटने प्रदान की गई है, और इस तरह वहाँ की आबादी में बिना खतना के गुणसूत्र substrates के कोई महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि है (जी Manthey एंड ए Bailis है, अप्रकाशित) परिणाम. जीनोमिक दक्षिणी और गुणसूत्र उनकी धब्बा विश्लेषण - बचे इंगित करता है कि कोशिकाओं को अक्सर एक, दूसरे, या दोनों में कटौती क्रोमोसोम खो और व्यवहार्य रहना (एल लिडेल और ए Bailis, अप्रकाशित परिणाम ). महत्वपूर्ण बात, लगभग बराबर गैर चयनात्मक माध्यम पर चढ़ाना क्षमता पहले और बाद में हो - endonuclease की अभिव्यक्ति की प्रेरण इंगित करता है कि न तो टूटी गुणसूत्रों की मरम्मत की विफलता है, और न ही विफलता स्थानान्तरण गुणसूत्रों को बनाए रखने के DSB गठन जीवित रहने की क्षमता को प्रभावित करता है. इस के अनुरूप, tXV गुणसूत्र III के स्थानान्तरण करने के लिए चयन के अभाव में mitotic कोशिकाओं में अस्थिर हो दिखाया गया है. यह tXV बढ़ रही द्वारा प्रदर्शन किया गया था: III उसकी + recombinants रातोंरात गैर चुनिंदा युक्त, गैर चयनात्मक प्लेटों पर एकल कालोनियों चढ़ाना, और चयनात्मक हिस्टडीन कमी मध्यम पर प्रतिकृति चढ़ाना. : III स्थानान्तरण गुणसूत्र (एन Pannunzio एंड ए Bailis, अप्रकाशित परिणाम): इन प्लेटों पर उत्पन्न होने वाली कालोनियों के दस से 70% tXV खो दिया था.
स्थानान्तरण मानव में IR जोखिम से उत्पन्न क्रोमोसोम एक समान 26 अस्थिरता दिखा रहे हैं. यह पता चलता है कि स्थानान्तरण गठन heterozygosity की हानि को बढ़ावा देने के द्वारा tumorigenesis में जल्दी घटनाओं के लिए योगदान कर सकते हैं. दूसरा, व्यापक आनुवंशिक और आणविक विश्लेषण सुझाव है कि सर्व शिक्षा अभियान, मानव संसाधन के एक कुशल और अनिवार्य गैर रूढ़िवादी तंत्र,, मानव संसाधन द्वारा स्थानान्तरण गठन के प्राथमिक तंत्र दो 12,27,28 गुणसूत्रों पर DSBs के साथ - साथ निर्माण के बाद. यह सह हैखोजने के साथ nsistent है कि खमीर जीनोम में एकाधिक दोहराए दृश्यों को निकट टूट जाता है बनाने के लिए पर्याप्त DSBs के घनत्व, और मानव संसाधन द्वारा स्थानान्तरण के गठन के एक उच्च आवृत्ति में IR परिणाम की बड़ी खुराक. साथ में, इन टिप्पणियों का सुझाव है कि मानव में IR जोखिम के oncogenic प्रभाव हिस्से में हो सकता है, मानव संसाधन के एक कुशल व्यवस्था है कि translocations है कि अपने निहित अस्थिरता के माध्यम से, आनुवंशिक परिवर्तन है कि लांच tumorigenesis बढ़ावा देने उत्पन्न द्वारा DSBs की मरम्मत से परिणाम. क्योंकि अक्सर विकिरण कैंसर, जीनोम rearrangements का इलाज है कि विकिरण प्रेरित DSBs की मरम्मत से परिणाम माध्यमिक कैंसर है कि रोगियों में अक्सर उठता है की पीढ़ी के लिए योगदान कर सकते हैं प्रयोग किया जाता है. इस प्रकार, इस मॉडल हमें आईआर उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक प्रतिक्रिया की आनुवंशिक और आणविक आधार के एक बेहतर समझ पाने में मदद मिल सकती है.
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
यह काम स्वास्थ्य और आशा की सिटी के Beckman अनुसंधान संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया था. हम उनके रचनात्मक टिप्पणियों है कि पांडुलिपि के लिए स्पष्टता जोड़ी के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
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Excellent article :)
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ReplyPosted by: William E.September 27, 2011, 10:30 AM