JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

Erkännande av Epidermal transglutaminas av IgA och Tissue transglutaminas 2 antikroppar i ett enstaka fall av Rhesus Dermatit

1, 1, 2, 3, 2, 2

1Division of Microbiology, Tulane National Primate Research Center, 2Division of Comparative Pathology, Tulane National Primate Research Center, 3Division of Veterinary Medicine, Tulane National Primate Research Center

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.227.41.242, User IP: 54.227.41.242, User IP Hex: 920857074

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Dermatitis herpetiformis (DH) är en kronisk inflammatorisk tillstånd som kännetecknas av en autoimmun reaktion mellan IgA och epidermal transglutaminas (ETG). DH utvecklas i en mycket liten del av gluten-känsliga och / eller celiaki patienter. Resultaten från denna studie indikerar att DH också kan utvecklas i en rhesusapa värd med symtom på idiopatisk dermatit.

    Date Published: 12/15/2011, Issue 58; doi: 10.3791/3154

    Cite this Article

    Sestak, K., Mazumdar, K., Midkiff, C. C., Dufour, J., Borda, J. T., Alvarez, X. Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis. J. Vis. Exp. (58), e3154, doi:10.3791/3154 (2011).

    Abstract

    Tissue transglutaminas 2 (tTG2) är en intestinal matsmältningsorganen enzym som deamidates redan delvis smälta födan gluten peptider t.ex. gliadin. I genetiskt predisponerade individer, triggers tTG2 autoimmuna reaktioner som kännetecknas av produktionen av tTG2 antikroppar och deras direkta nedfallet i små tarmväggen 1,2. Förekomsten av sådana antikroppar utgör en av de viktigaste kännetecknen för celiaki (CD). Epidermal transglutaminas (ETG) är en annan medlem av transglutaminas familjen som också kan fungera som ett autoantigen i en liten minoritet av CD patienter. I dessa relativt sällsynta fall utlöser ETG en autoimmun reaktion (hudutslag) kliniskt kallas dermatitis herpetiformis (DH). Även om den exakta mekanismen för CD och DH patogenes inte är väl beskriven, är det känt att tTG2 och ETG epitoper dela antigen som kan kännas igen av antikroppar från både CD och DH patienter 3,4.

    (Macaca mulatta) med dermatit (tabell 1, figur. 1 och 2) användes för att studera de drabbade vävnaderna. I ett djur (EM96) en spektral överlappning av IgA och tTG2 antikroppar (Fig. 3) visades. Förekomsten av dubbla positiva tTG2 + IgA + celler var fokuserad i det djupa överhuden, runt dermal papiller. Detta överensstämmer med skador som beskrivs i DH patienter 3. När EM96 var placerad på en glutenfri kost, dermatit, liksom tTG2 + IgA + insättningar försvann och var inte längre detekterbar (bild 1-3). Dermatit återkom dock, baserat på återinförande av kosten gluten i EM96 (visas ej). I andra makaker inklusive djur med oberoende dermatit var tTG2 + IgA + insättningar inte upptäcks. Glutenfri kost-beroende eftergift av dermatit i EM96 tillsammans med närvaron av tTG2 + IgA + celler i huden antyder en autoimmun, DH-liknandemekanism för utveckling av detta tillstånd. Detta är den första rapporten från DH-liknande dermatit hos icke-mänskliga primater.

    Protocol

    1. Hudbiopsi provtagning

    1. Innan hudbiopsi förfarande, bedöva djur intramuskulärt med 2,5 mg / kg tiletamine hydroklorid och zolazepam hydroklorid telazol blandning (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Övervaka djur från administrationen av narkos tills VILA och ta sedan ut från sin inhägnad.
    2. Ta bort hår från huden område av intresse att använda en Oster Golden A5 Single Speed ​​veterinärmedicinska Clipper med en storlek 40 blad (Oster Professionella Produkter, McMinnville, TN) och aseptiskt förbereda med omväxlande Betadine scrub och alkohol. Säkert en steril Fenestrated drapera över det valda biopsi webbplats.
    3. Med hjälp av en steril teknik, en 4,0 mm Miltex Punch Dermal Biopsi instrument (Miltex, York, PA) mot huden samtidigt som roterar instrumentet 180 grader medurs och moturs med lätt tryck tills biopsi Punch transekter genom huden skikt i subkutan TIssue. Ta bort biopsi prov och ta tag i transected delen av huden med pincett och fri från den subkutana vävnaden.
    4. Stäng huden felet med 3-0 nylon sutur ansluten till en 3 / 8 cirkel skärande nål (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson AB, Berkshire, Storbritannien) i en cruciate mönster. Ge alla djur 0,01 mg / kg buprenorfinhydroklorid (Hospira, Lake Forest, IL) intramuskulärt för postoperativ smärtlindring.

    2. Exempel på behandling

    1. Arbeta med hudbiopsi prover från kroniska eksem och friska kontrollpersoner makaker rhesus. Få två till tre (4 mm i diameter) biopsi prover från varje djur.
    2. Fix första provet i zink formalin (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) i 24 timmar, tvätta med vatten i 30 min, skölj kort i 70% etanol, och placera i ASP300 Leica vävnad processor (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS) där vävnaden är uttorkad med stigande grader av 70%, 80%, 95% och 100% etanol 48min vardera (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), följt av två byten av xylen (Fisher).
    3. Bädda in i paraffin media (Fisher) för långvarig förvaring i rumstemperatur. Placera vid -20 ° C i 20 minuter innan snittning. Förbered 6 ìm sektioner med hjälp av en roterande mikrotom (HM325, microM International, Waldorf, Tyskland). Placera delarna på uppladdade bilder (Fisher) och lufttorka på 60oC över natten. Fläcken med hematoxylin och eosin (H & E)-metoden (beskrivs nedan).
    4. Fix andra prov i 2% paraformaldehyd (USB Corp, Cleveland, OH) i 30 minuter i rumstemperatur, tvätta tre gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), plats 30% sackaros (Fisher) för 4 timmar och bädda in i oktober frysning medium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Förvara vid -80 ° C-i 20 minuter innan snittning. Förbered 15 ìm sektioner med kryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).

    3. H & E färgning

    1. Deparaffinize bäddaDED sektioner genom tre förändringar av xylener (Fisher) och återfuktar genom graderas prover av: tre byten av 100%, två byten på 95%, en förändring på 80% och destillerat vatten, 2 min vardera.
    2. Fläcken med hematoxylin (Richard-Allan Vetenskapliga, Kalamazoo, MI) för en min och följ av en kort Tvätta i rinnande kranvatten.
    3. Motfärga med eosin (Sigma) för 6 min.
    4. Torka färgade vävnader med hjälp av 95% och absolut etanol, två byten av 2 minuter vardera och sedan klara i tre förändringar av xylener, 3 min vardera.
    5. Mount coverglass använda Cytoseal Mounting Medium (Richard-Allan vetenskapligt) över H & E-färgade snitt vävnad.

    4. Histopatologiska utvärderingen

    Inspektera H & E-färgade biopsi sektioner huden under ett ljusmikroskop med 4 - 40x förstoring och Leica mikroskop med en SPOT Insight digitalkamera (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).

    5. Immunofluorescens staiNing

    1. Arbeta med oktober-inbäddade hud sektioner för immunofluorescens färgning. Före färgning, blöt i 20 minuter i PBS som innehåller 0,2% gelatin fiskskinn (FSG, Sigma) med 0,1% Triton X-100 (Sigma) för att ta bort oktober och permeabilize vävnaden.
    2. Efter tvättning av diabilder, inkubera med 10% normal get serum (NGS, Sigma), som spätts i PBS-FSG under 1 timme, i rumstemperatur, i en fuktig bild kammare.
    3. För att visualisera deposition av IgA och tTG2 antikroppar, inkubera objektglasen med anti-Rhesus IgA och tTG2 primära antikroppar, utspädd i 10% NGS-PBS-FSG i 1 timme.
    4. Tvätta med PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) i 10 min, följt av PBS-FSG i 10 min.
    5. Odla med sekundär, isotyp-specifika antikroppar märkta med Alexa Fluor fluorokrom 488 (grön), 568 (röd) eller 633 (blå) (molekylära sonder-Invitrogen) vid 1:1,000 spädning. Använd ToPro-3 färgämne för att visualisera nukleärt DNA. Använd 10% NGS-PBS-FSG som en antikropp spädningsmedel.
    6. Använd anti-släcka-lösning (Sigma) för att montera det färgade vävnadssnitt.

    6. Konfokala imaging

    Utför avbildning med en Leica TCS SP2 Sann Confocal laserscanning mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) utrustad med tre lasrar (sex linjer för excitation finns): en argon-krypton laser vid 488 nm (grön), en krypton laser vid 568 nm ( rött) och en helium-neon laser vid 633 nm (blå), som spänner från synliga för långt röda sidan av spektrumet. Spela in differential interferens kontrast (DIC) bilder för utvärdering av icke-märkta vävnad arkitektur.

    7. Representativa resultat

    Ett exempel på positivt erkännande av ETG av både tTG2 och IgA-antikroppar visas i figur. 3A. Överensstämmer med situationen hos människor och på grund av mycket lägre förekomst av DH-liknande dermatit än CD-liknande gluten känsligheten också i rhesus makaker, de flesta av hudbiopsi proverna väntas show den positiva reaktionen med tTG2 antikroppar men utan närvaro av tTG2 + IgA + dubbla positiva celler (bild 4). Dessa DH-orelaterade ärenden, inklusive dermatit fall av mikrobiellt ursprung, kommer att avslöja några enstaka positiva IgA + celler utspridda under epitelet men inte spektral överlappning mellan tTG2 och IgA-märkta markörer (Fig. 3B och 4). Därför är det viktigt att behålla den ordning som föreslås testförfaranden, som börjar med klinisk undersökning (Fig. 1), följt av histopatologiska utvärderingen (Fig. 2) och endast om inga andra, mer vanliga eksem som orsakar agenter kan identifieras, konfokal mikroskopi undersökning av hud biopsier färgas för tTG2 och IgA är motiverad. Kliniska och / eller histopatologiska utvärderingar räcker inte för positiv diagnos av detta tillstånd. I de fall dubbel-positiva (tTG2 + IgA +) celler identifieras runt området dermal papiller kan DH-liknande dermatit diagnos utfärdas. I sådana fall indragning av kosten glutenoch administration av glutenfri kost rekommenderas för att lindra eksem symptom.

    Figur 1
    Figur 1. Inguinal regionen EM96 makak före (A) och efter (B) tillbakadragande av kosten gluten i 5 veckor. Återinförande av kosten gluten sammanföll med återkomsten av dermatit (C).

    Figur 2
    Figur 2. HE färgning av EM96 makak hud biopsier samlas före (A) och efter (B) tillbakadragande av kosten gluten för 9 veckor. A: Epitel är förtjockad (7-15 lager av epitelceller) med en tjock ytlig skorpa hyperkeratotiska celler infiltrerade med degenererade neutrofiler. Neutrofiler visas också inne i epitel och blandas med måttlig antal lymfocyter, plasmaceller och histiocyter runt adnexa i övre dermis. B: Vissa hyperkeratOsis är fortfarande närvarande är epitelial tjocklek normaliserad (4-7 lager) med minimal lymphoplasmacytic infiltration i övre dermis. C: Normal bukhuden från FR56 makak, utan lymphoplasmacytic infiltration, ingår för jämförelse. Förstoring 20x.

    Figur 3
    Figur 3. Konfokalmikroskopi bilder av EM96 makak hud biopsier samlas före (A) och efter (B) tillbakadragande av kosten gluten för 9 veckor. A: IgA färgning (grön), tTG2 (röd) och ToPro-3 nukleära DNA-markör (blå). Co-lokalisering av IgA och tTG2 visas i gult runt området dermal papilae. B: Hud prov som tagits efter 9 veckor av glutenfri kost visar inga IgA inom epitel medan vissa subepitelial IgA är fortfarande närvarande (grön), tTG2 (röd) och ToPro-3 nukleära DNA-markör (blå).

    Figur 4
    Figur 4.

    Animal Tagg Kön
    [M / F]
    Ålder
    [År]
    Kliniska symtom Plasma tTG2
    antikroppar
    Diet
    [1,2] *
    HJ71 F 1,3 Friska - 1
    HD13 M 1,4 Friska, tillfällig diarré + 1
    FR56 M 5,4 Kronisk idiopatisk diarré - 1
    EM96 F 5,0 Kronisk dermatit + / - (Borderline) 1 och 2
    GI24 F 4,6 Kronisk dermatit - 1

    Tabell 1. TNPRC rhesus makaker som används för insamling av hud biopsier

    * Diet 1 - regelbundna apa chow (gluten-innehållande), Diet 2 - glutenfri diet

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vår nybildade icke-mänskliga primater modell av gluten känslighet användes nyligen för att studera tarmens permeabilitet förändringar till följd av kosten gluten 5,6. Plasma tTG2 antikroppar samt intestinal tTG2 + IgA + avlagringar upptäcktes hos några gluten känsliga makaker. Eftersom vi nyligen identifierat sällsynta fall av idiopatisk dermatit i kolonin rhesus makaker, där inga vanliga (infektiösa / ämnesomsättning) etiologi kunde fastställas, var syftet med denna studie för att utvärdera om tTG2 + IgA + antikroppar depositioner kunde påvisas i huden prover från dessa sällsynta fall av dermatit (tabell 1).

    Förekomst av tTG2 autoantikroppar som är ett tecken på CD varierar mellan 1:70 och 1:200 7. Våra studier med gluten känsliga makaker visar att förekomsten av tTG2 antikroppar i fångenskap rhesus makaker liknar den som rapporterats från mänskliga befolkningen. Primär miljömässiga och genetiska faktorer som kan påverka den mån of sådan förekomst hos både människor och makaker är understudied 8,9. Faktorer som är förknippade med lägre förekomst av DH (1:400 till 1:10,000) än CD är inte heller kända. Därför är mer rigorös forskning för att studera CD och DH patogenes. Denna rapport är den första att påvisa förekomsten av DH-liknande dermatit i icke-mänskliga primater. Trots att förekomsten av DH-liknande dermatit verkar vara mycket lägre än förekomsten av gluten känsliga enteropati också i makaker, presenterade resultat ger hopp om framtida forskning, förutsatt att ytterligare djur med DH-liknande dermatit kommer att identifieras. Detektering av dubbel-positiva tTG2 + IgA + celler i huden biopsier berörda djur av konfokalmikroskopi är avgörande för att sådana insatser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgements

    Författarna vill tacka Amanda Tardo, Dr Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr Erin Ribka, Dr Pete Didier och Dorothy Kuebler för tekniskt bistånd. Detta arbete fick stöd av NIH bidrag R01-DK076653 och 3R01-DK076653-02S1 till KS och basen driftsbidrag av TNPRC RR000164.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-Human IgA-FITC * Sigma-Aldrich F-5259 1:100 working dilution
    Anti-Human tTG2 Thermo Fisher Scientific, Inc. MS-300-P1ABX 1:100 working dilution
    Anti-Mouse IgG1 ** Invitrogen A-21124 1:1,000 working dilution
    ToPro-3 DNA probe *** Invitrogen T-3605 1:1,000 working dilution
    Zinc Formalin (Z-fix) Anatech Ltd., Battle Creek, MI 171
    OCT Freezing Medium Sakura Finetek 4583
    Cytoseal Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8312-4
    Anti-Quenching Solution Sigma-Aldrich P 3130
    Ethilon (Nylon Suture) Ethicon Inc. 663G
    Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument Miltex Inc. NA
    Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade Oster Professional Products 78005-050
    Leica Tissue Processor Leica Microsystems ASP300
    Rotary Microtome Microm International HM325
    Cryostat Thermo Fisher Scientific, Inc. HM560
    Confocal Microscope Leica, Wetzlar TCS SP2
    * Fluorescein isothiocyanate
    ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody
    ** Dye

    References

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter