माउस भ्रूण के ईथीलीन कांच में रूपांतर Glycol - आधारित द्वारा cryopreservation

Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

माउस भ्रूण की cryopreservation एक तकनीकी आधार है कि जैव चिकित्सा विज्ञान का समर्थन करता है, क्योंकि चूहों के कई उपभेदों आनुवंशिक संशोधनों द्वारा निर्मित किया गया है और संख्या लगातार वर्ष द्वारा वर्ष बढ़ रही है. इसके तकनीकी विकास 1970 के दशक के ^एक में धीमी गति से ठंड तरीकों के साथ शुरू किया, तो कांच में रूपांतर ^देर से 1980 2 में विकसित तरीकों के द्वारा पीछा किया. आम तौर पर, उत्तरार्द्ध तकनीक अपने वेग, सादगी, और बरामद भ्रूण के उच्च survivability में फायदेमंद है. हालांकि, निहित cryoprotectants बेहद जहरीला कर रहे हैं और बाद में भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकता है. इसलिए, इस तकनीक चूहों के कुछ उपभेदों के लिए लागू नहीं किया गया था जब भी समाधान 4 करने के लिए ठंडा कर रहे हैं ° C भ्रूण से निपटने के दौरान विषाक्त प्रभाव कम करने के लिए. आरआईकेईएन BioResource केंद्र में 5000 से अधिक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि और phenotypes के साथ माउस ^{उपभेदों} 3 रखा जाता है, और इसलिए हम एक कांच में रूपांतर ते अनुकूलितchnique जिसके साथ हम चूहों के कई अलग अलग उपभेदों से भ्रूण cryopreserve vitrifying और परिवेश के तापमान पर ⁴ विगलन (या liquefying, और अधिक ठीक) के बाद उच्च भ्रूण अस्तित्व के लाभ के साथ कर सकते हैं.

यहाँ, हम माउस भ्रूण कि सफलतापूर्वक किया गया है हमारे केंद्र पर इस्तेमाल के लिए एक कांच में रूपांतर विधि उपस्थित थे. cryopreservation समाधान ethylene DMSO के बजाय glycol ⁵ भ्रूण विषाक्तता कम से कम होता है . यह भी Ficoll और विकांचीकरण और आसमाटिक समायोजन की रोकथाम के लिए sucrose क्रमशः होते हैं,. भ्रूण कमरे के तापमान पर संभाला जा सकता है और 5 मिनट के भीतर तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित. क्योंकि मूल विधि प्लास्टिक कंटेनर के रूप में तिनके के लिए अनुकूलित किया गया था, हम थोड़ा cryotubes है, जो अधिक आसानी से सुलभ और प्रयोगशालाओं में अधिक शारीरिक नुकसान के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया है. हम भी विस्तार में vitrified भ्रूण विगलन की प्रक्रिया का वर्णन है क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण Ste के हैजीवित चूहों के कुशल वसूली के लिए पी. ये तरीके शोधकर्ताओं और तकनीशियनों, जो बाद में उपयोग के लिए माउस उपभेदों के संरक्षण की जरूरत है एक सुरक्षित और लागत प्रभावी ढंग में मददगार होगा.

प्रयोग की समग्र योजना छवि में दिखाया गया है. 1.

1. अभिकर्मक तैयार

1. एक 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में निम्नलिखित चार्ट के अनुसार आधार मध्यम (में यहाँ PB1 रूप में जाना जाता है):

   	मेगावाट	मिमी	mg/100ml
   NaCl	58.4	136.98	800.0
   KCl	74.6	2.68	20.0
   के.एच. 2 पीओ 4	136.1	1.47	20.0
   ना 2 HPO 4 .12 एच 2 हे	358.14	8.04	288.1
   2 MgCl, 6 2 हे	203.3	0.49	10.0
   180.2	5.56	100.0
   ना पाइरूवेट	110	0.33	3.6
   2 CaCl, 2 हे 2H	147	0.9	13.2
   पेनिसिलीन जी			6.0 (लगभग)

2. समाधान Ficoll sucrose (एफएस):
   1. PB1 समाधान के एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 14 मिलीग्राम के लिए निम्नलिखित रसायनों जोड़ें.

      70 Ficoll	6.0 छ
      इक्षुसिता	3.424 ग्राम
      BSA	42.0 मिलीग्राम

   2. 70 Ficoll और PB1 समाधान में sucrose मिक्स और अच्छी तरह हिला जब तक पूरी तरह भंग है.
   3. पूरा विघटन ऊपर की जाँच करने के बाद, समाधान की सतह पर BSA जोड़ने और इसे रख परBSA जब तक 4oC पूरी तरह भंग कर रहा है (> 4 घंटे या रात भर).
3. संतुलन (EFS20) और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में कांच में रूपांतर समाधान (EFS40) समाधान करें:
   • EFS20: 20% (v / v) ethylene glycol, 24% (w / v) Ficoll, और 0.4 BSA साथ mol / एल PB1 में sucrose
   • EFS40: 40% (v / v) ethylene glycol, 18% (w / v) Ficoll, और 0.3 mol / एल PB1 में BSA के साथ ^* sucrose
     ^* BALB / ग या ICR तनाव से भ्रूण के लिए, 0.9 sucrose / mol एल sucrose की एकाग्रता को बढ़ाता है क्योंकि वे अधिक ^से 6 cryodamage संवेदनशील हैं .

   	EFS20 समाधान	EFS40 समाधान
   Ethylene glycol	1 मिलीलीटर	2 मिलीलीटर
   एफएस समाधान	4 मिलीलीटर	3 मिलीलीटर

4. 0.45 सुक्ष्ममापी filte का उपयोग निस्पंदन द्वारा समाधान जीवाणुरहितआर 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब और दुकान में 4 बजे aliquots बनाओ डिग्री सेल्सियस वे के बारे में 6 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. भ्रूण विगलन 0.75 एम sucrose (TS1) युक्त समाधान की तैयारी
   1. PB1 में 7.7 sucrose के g (1.1 चरण में तैयार) भंग और 30 मिलीलीटर कुल मात्रा लाने. कोमल झटकों से मिश्रण जब तक sucrose पूरी तरह भंग है.
   2. सतह के समाधान पर BSA के 90 मिलीग्राम जोड़ें और छोड़ खड़े हो जाओ जब तक पूरी तरह भंग है.
   3. निस्पंदन द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
   4. अशेष भाजक और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान वे के बारे में 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
   
   नोट: TS1 को भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध M2 से तैयार किया जा सकता है.
   
   6. M2 में sucrose के 7.7 ग्राम भंग और 30 मिलीलीटर कुल मात्रा लाने.
   7. कोमल झटकों से मिश्रण जब तक sucrose पूरी तरह भंग है.
   8. निस्पंदन द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
   9. अशेष भाजक और 4oC पर दुकान. वे के बारे में 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
6. TS2 (विगलन समाधान0.25 एम) sucrose युक्त:
   1. PB1 या M2 के 20 मिलीलीटर की मात्रा के साथ 10 मिलीलीटर TS1 पतला, के रूप में उपयुक्त.
   2. अशेष भाजक और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान वे के बारे में 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. 2 सेल माउस भ्रूण के कांच में रूपांतर

1. प्राकृतिक सहवास या इन विट्रो फर्टिलाइजेशन तकनीक में पारंपरिक द्वारा 2 सेल माउस भ्रूण तैयार करें.
2. Cryotube में 50 μl EFS40 अशेष भाजक. इसके बाद, कमरे के तापमान पर कांच में रूपांतर प्रक्रिया के बाकी करते हैं.
3. अशेष भाजक एक 35 मिमी या 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के तल पर 50 EFS20 के μl.
4. 30 भ्रूण को EFS20 एक मध्यम संस्कृति के केवल न्यूनतम राशि के साथ केशिका गिलास का उपयोग कर स्थानांतरण. 2 मिनट के लिए एक टाइमर शुरू करो.
   नोट: ड्रॉप के नीचे पर प्लेस भ्रूण. इस भ्रूण के कुशल निर्जलीकरण बनाता है. Stereomicroscope द्वारा भ्रूण की आकारिकी की जाँच करें. निर्जलित भ्रूण एक सिकुड़ा हुआ आकारिकी दिखाने के लिए, के रूप में छवि में दिखाया गया है. 2A.अगर वे पर्याप्त निर्जलित नहीं हैं, 1 या 2 मिनट के लिए रुको.
5. के बारे में 1.5 मिनट में, समाधान का केवल न्यूनतम राशि के साथ भ्रूण लेने EFS20 ड्रॉप से. EFS40 उन्हें कदम 2.1 में तैयार cryotube में स्थानांतरण. नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, उठा भ्रूण इतना है कि सभी भ्रूण के आसपास 2 मिनट में EFS40 में स्थानांतरित किया जा सकता है है के समय को समायोजित.
6. 1 मिनट के लिए रुको.
7. तरल नाइट्रोजन ₍₂ एल.एन.) में cryotube सीधे रखो.

3. Vitrified 2 सेल माउस भ्रूण विगलन

1. विगलन से पहले भ्रूण बरामद भ्रूण के लिए संस्कृति के माध्यम से 10 μl बूँदें (3.13 कदम देखें) के साथ एक डिश तैयार. कवर उपयोग करें जब तक तेल और सीओ ₂ इनक्यूबेटर में जगह के साथ पकवान . नोट: हालांकि नियमित भ्रूण संस्कृति के लिए किसी भी मीडिया के इस प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है, हम जैसे M16 मध्यम उच्च osmolarity के साथ मीडिया अनुशंसा करते हैं.
2. 37 सी. सेंटीग्रेड TS1 गर्म
3. एक चेहरा मुखौटा और cryogloves पर रखो. एल.एन. ₂ टी खोलेंank और एक भ्रूण युक्त cryotube पुनः प्राप्त.
4. जल्दी ट्यूब के ऊपर खुला और एल.एन. ₂ त्यागें. 30 सेकंड के लिए रुको ठंड से अगले कदम पर TS1 रोकने के.
5. 1000ul विंदुक प्रयोग ट्यूब में TS1 के 850 μl (37 डिग्री सेल्सियस) जोड़ सकते हैं और कोमल pipettings (25 सेकंड में के बारे में दस बार) द्वारा हल मिश्रण जब तक समाधान समान रूप से भंग कर रहा है.
6. एक प्लास्टिक की 60 मिमी पेट्री डिश (या एक घड़ी का शीशा) (छवि 3A) ट्यूब की पूरी मात्रा स्थानांतरण. नोट: भ्रूण कमरे के तापमान (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर नियंत्रित किया जाना चाहिए जब तक वे एक सीओ ₂ इनक्यूबेटर में 3.14 चरण पर रखा जाता है.
7. 3 मिनट के लिए एक टाइमर शुरू करो.
8. TS1 में लगभग 2 मिनट में, धीरे पकवान हिला जब तक भ्रूण युक्त मध्यम पकवान की सतह (3B छवि) में फैला हुआ है. नोट: यह भ्रूण तह तक नीचे जाने के कारण वे सतह के पास चल रहे हैं जब TS1 को हस्तांतरित करने में मदद करेगा.
9. वें पर TS2 के तीन 50 μl बूँदें रखोई पकवान (छवि 3C).
10. TS1 में 3 मिनट के बाद, एक stereomicroscope द्वारा भ्रूण की आकारिकी की जांच, वे थोड़ा सिकुड़ा हुआ होना चाहिए. पहले में भ्रूण की आकारिकी (छवि 2B) देखें और बाद में TS1 में (छवि 2C) . नोट: यदि भ्रूण अभी भी सूजन कर रहे हैं, TS1 में 1 से 3 मिनट के लिए और अधिक के लिए उन्हें रखना.
11. भ्रूण उठाओ और उन्हें TS2 की पहली बूंद (छवि 3 डी) को हस्तांतरण. 3 मिनट के लिए एक टाइमर प्रारंभ
12. 3 मिनट के बाद, दूसरे ड्रॉप करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण और फिर तीसरे ड्रॉप (3E छवि) के लिए .
13. संस्कृति 3.1 चरण में तैयार मध्यम भ्रूण स्थानांतरण. भ्रूण आकार में छवि में दिखाया गया हैं. 2D.
14. सीओ ₂ इनक्यूबेटर में रखें पकवान. के बारे में 10 मिनट के बाद, संस्कृति के माध्यम से बाहर sucrose है कि TS2 से किया गया है खत्म किया धो अगले ड्रॉप करने के लिए भ्रूण हस्तांतरण.
15. भ्रूण स्थानांतरण तक संस्कृति एक CO2 इनक्यूबेटर में जारी रखें.
    नोट: स्थानांतरण Embryविगलन के दिन पर प्राप्तकर्ता महिलाओं के oviducts ओएस. इन विट्रो में लंबे संस्कृति चूहों के कुछ उपभेदों में भ्रूण की व्यवहार्यता कम हो सकती है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

इन विट्रो में और भ्रूण के vivo विकास के बाद विगलन टेबल्स 1 और 2 में प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल का लाभ विगलन और चूहों के विभिन्न प्रकारों के लिए अपने व्यापक प्रयोज्यता के बाद भ्रूण की उच्च survivability हैं.

तालिका 1. Vitrified-thawed भ्रूण की सामान्य माउस उपभेदों में इन विट्रो विकास में

टेबल 2 C57BL/6J चूहों में vitrified-thawed भ्रूण के vivo विकास में.

चित्रा 1संतुलन, कांच में रूपांतर, और भ्रूण का विगलन सहित प्रयोग की समग्र योजना.

चित्रा 2. विगलन के हर कदम पर भ्रूण के morphology.

चित्रा 3 भ्रूण की प्रक्रिया विगलन. कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन कर रहे हैं. (ए), एक cryotube में TS1 (37 डिग्री सेल्सियस) के 850 μl जोड़ें और एक प्लास्टिक पकवान पर cryotube में समाधान की पूरी मात्रा हस्तांतरण. इस समय, भ्रूण सूजन देखो के रूप में चित्र में दिखाया गया है. 2B. (बी), कोमल झटकों से पकवान की सतह पर समाधान फैलाओ. (सी), प्लास्टिक पकवान पर TS2 के तीन 50 μl बूँदें प्लेस. (डी), TS2 की पहली बूंद के लिए भ्रूण स्थानांतरण. 3 मिनट के बाद, भ्रूण shurunken देखो के रूप में छवि में दिखाया गया है. 2C. (ई), उन्हें धारावाहिक स्थानांतरणशेष TS2 में ly बूँदें और फिर संस्कृति के माध्यम से.

Rall और Fahy द्वारा माउस भ्रूण के कांच में रूपांतर के ^पहले दो 1985 में रिपोर्ट के बाद से, कई तकनीकी सुधार विगलन के बाद भ्रूण के survivability बढ़ाने के लिए बनाया गया है. सबसे सफल संशोधनों के ethylene glycol के उपयोग की वजह से अपनी कम विषाक्तता और उच्च झिल्ली पारगम्यता cryoprotectant के रूप में हासिल की थी. इस तरह के लाभ हमें कमरे के ^{तापमान} पर 4 ठंड भ्रूण को संभालने के लिए सक्षम, अन्य कांच में रूपांतर तरीकों कूलर तापमान में सौंपने भ्रूण की आवश्यकता होती है और हमेशा ^BALB / 6 ग सहित चूहों के कुछ उपभेदों के लिए लागू नहीं कर रहे हैं. पहली ethylene glycol आधारित कांच में रूपांतर Kasai एट अल द्वारा विकसित किया गया था. ^5,7 १,९९० में. क्योंकि मूल विधि प्लास्टिक कंटेनर के रूप में तिनके के लिए अनुकूलित किया गया था, हम थोड़ा cryotubes है, जो अधिक आसानी से सुलभ और प्रयोगशालाओं में अधिक शारीरिक नुकसान के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया है. इसलिए, कांच में रूपांतर विधि यहाँ वर्णित app हो सकता हैकई अनुसंधान मॉडल के रूप में चूहों का उपयोग प्रयोगशालाओं को licable. एक ही विधि भी morula और ब्लास्टोसिस्ट ^{चरणों 8} और ^चूहे 9 भ्रूण माउस भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हम हाल ही में पाया है कि cryotubes की गुणवत्ता ठंड के विगलन के बाद भ्रूण के जीवित रहने की दरों को प्रभावित कर सकता है. इस प्रकार, यह आवश्यक है vitrifying भ्रूण (जैसे, विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की टेबल पर देखें) से पहले अपनी चिकनाई के लिए cryotubes के अंदर सतह की जांच करने के लिए.

कांच में रूपांतर तरीकों पारंपरिक धीमी ठंड तरीकों पर कई फायदे हैं, लेकिन वे स्वाभाविक परिवहन के उद्देश्य के संबंध में एक नुकसान है. Vitrified भ्रूण के रूप में -120 नीचे रखा जाना चाहिए सी उनकी व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए °, सूखी shippers आम तौर पर अपने सुरक्षित परिवहन के लिए उपयोग किया जाता है. ड्राई shippers और भारी भारी रहे हैं, और उनके राउंड ट्रिप महंगा अंतरराष्ट्रीय ढुलाई के लिए विशेष रूप से है. अब हम वर्तमान में कर रहे हैं के द्वारा एक नई कांच में रूपांतर विधि विकसितजो vitrified भ्रूण सूखी बर्फ के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है (-80 ° सी के बारे में) के कम से कम ^{7 10} दिनों के लिए. इस विधि अगली पीढ़ी के कांच में रूपांतर किया जाना चाहिए.

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यह अध्ययन राष्ट्रीय BioResource परियोजना के साथ सहयोग में आयोजित किया गया, शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान, प्रौद्योगिकी और, जापान.

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2. Rall, W.F. & Fahy, G.M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
3. Yoshiki, A., et al. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
4. Mochida, K. & Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
5. Kasai, M., et al. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
6. Dinnyes, A., Wallace, G.A., & Rall, W.F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
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8. Miyake, T., et al. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
9. Han, M.S., Niwa, K., & Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
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