Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare

1. Preparazione filtro per rimuovere estraibili

1. Utilizzare 25 mm di diametro 0,22 micron pori di dimensioni Durapore filtri PVDF idrofilo (Millipore). Mettere filtri in un bicchiere pulito da 500 ml Pyrex con una pinzetta. Pre-risciacquo tre volte con acqua distillata. Agitare così come si risciacquo per evitare che i filtri si attacchino tra loro. Aggiungere 300 ml Milli-Q (Millipore) o equivalente di alta qualità dell'acqua. Autoclavare per facilitare la rimozione completa estraibili dai filtri.
2. Eliminare il Milli-Q e di nuovo triple lavare i filtri, questa volta con Milli-Q. Utilizzo dei filtri singoli pinzette posto su una superficie asciutta e pulita (come il foglio di alluminio) e sia asciutto ad una temperatura ragionevole (per esempio 37 ° C) o aria secca. I filtri sono ora pronti per l'uso.

2. Filtrazione di materiale campione

1. Per dimostrare questo protocollo, Millipore in acciaio inox a 3 posti collettore filtro con 25 mm di microanalisi colonne filtro con supporti in vetroe una pompa meccanica vengono utilizzati. Usando una tecnica asettica, inserire un singolo da 25 mm filtro sulla base della colonna filtro, applicare la colonna e fissarlo insieme.
2. Caricare 15 ml di campione alla colonna, aprire l'otturatore sul collettore del filtro, e accendere la pompa. Filtrare sotto una leggera pressione per minimizzare la rottura delle cellule (<5 kPa). Altre pompe, come la mano o una pompa peristaltica può essere adattato a questo protocollo. Per i campioni a bassa densità, successive aggiunte di acqua può essere necessaria, non lasciare andare il filtro a secco per un periodo prolungato di tempo tra le aggiunte di acqua.
3. Per i campioni marini, dopo aver filtrato il campione, è possibile eseguire un risciacquo acqua dolce opzionale per ridurre gli ioni paramagnetici residui nel campione e sul filtro. Questo può aiutare con più precisa messa a punto del magnete dello spettrometro. Basta aggiungere delicatamente una piccola quantità di acqua e filtrare attraverso il vostro campione prelevato alla fine.
4. Una volta che il filtraggio è finito, spegnere la pompa, e lasciare la valvola di Open quindi c'è ancora pressione negativa sotto il filtro. Rimuovere il morsetto e la colonna filtro.
5. Con una mano, utilizzare pinzette pulite a prendere piede del filtro. Piegare il filtro tra sé, ma non piega. Con l'altra mano usare il labbro di un sterile da 2 ml provetta a tenere premuto il filtro. Rilasciare le pinzette poi usarli per ri-afferrare entrambi i bordi del filtro. Regrip a 45 ° angolo di piega.
6. Posizionare il filtro nel tubo da 2 ml e il rilascio in modo che si apre con il lato rivolto verso l'interno del campione. È possibile inserire fino a due filtri nel tubo da 2 ml sterile microcentrifuga in questo modo. Se si utilizzano due filtri, si sovrappongono garantire il meno possibile. Immediatamente congelare (almeno -30 ° C).

3. Estrazione di acquosa solubili metaboliti

1. Liofilizzare i campioni durante la notte o per almeno 10 ore.
2. Dopo la liofilizzazione, aggiungere un frantoio in acciaio inox ad ogni provetta (Tokken). Aggiungere 750 microlitri di potassio standardizzatotampone fosfato NMR in ossido di deuterio ⁽² H> 90%) con 2,2-dimetil-2-silapentane-5-solfonato (DSS) standard (KPI; 38,3 mM KH ₂ PO _4, il 61,7 mM K ₂ HPO _4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% D ₂ O) ^2.
3. Sonicare i campioni per 5 minuti a 4 ° C in un sonicatore acqua (Bioruptor, Diagenode) per rimuovere il materiale cella dal filtro. Rimuovere i filtri con pinzette pulite.
4. Frantumare le cellule utilizzando un frantoio a mulino (1600 rpm) per 5 minuti.
5. Incubare a 65 ° C con agitazione (1400 rpm) su un banco agitatore (Eppendorf) per 15 minuti.
6. Rimuovere il maiale metallo con pinzette pulite, e centrifugare il campione a 13.000 g per 5 minuti.
7. Disegnare il sopranatante direttamente ad un tubo NMR per spettroscopia NMR.

4. Spettroscopia NMR e Analisi dei Dati

1. Caricare il campione in uno spettrometro NMR (qui, un Bruker DRX-500 equipaggiato con spettrometroSonda TXI con tre assi gradiente controllato da un computer che esegue XWIN-NMR).
2. Ottenere 1D ¹ H spettri NMR con adeguati metodi precedentemente pubblicati ^2,15 dal XWIN-NMR interfaccia. Nel presente studio ¹ H NMR sono stati registrati su un sistema operativo DRX-500 spettrometro a 500,03 MHz a 298 K. acqua segnali residui sono state soppresse dalla sequenza di impulsi Watergate, con un tempo di ripetizione di 1,2 s. 128 transitori sono stati raccolti per ottenere 32.000 punti dati per spettro.
3. Trasferire le directory dei dati NMR ad un PC installato il software NMRPipe ^16. Elaborare i dati grezzi e DSS set a 0 di riferimento ppm quindi manualmente eliminare gli spettri. Digitalizzazione dei dati spettrali in un insieme di valori discreti, integrando o 'categorizzazione' con software come rNMR, Automics, o utilizzando il pacchetto FT2B pubblicamente disponibili sul sito web ECOMICS ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) ^3,17. In thè, ad esempio, gli spettri sono stati integrati tra 0,5 e 10,5 ppm oltre 0.032 regioni ppm integrale con ECOMICS e normalizzati al DSS sia o intensità del segnale totale. I dati in uscita possono ora essere utilizzati per la valle analisi statistiche come analisi delle componenti principali (PCA) con pacchetti di software libero come R ^18.

5. Risultati rappresentativi

Un esempio di spettri ¹ H NMR ottenuti utilizzando i metodi di cui sopra sono mostrati nella Figura 1. Questi campioni, da due punti di tempo di un esperimento microcosmo mostrano differenze evidenti a causa di alghe attività metaboliche. Il giorno 4 spettro mostra picchi di abbondanza considerevole, in particolare nell'intervallo 3-4 ppm rispetto al giorno 1 campione. Questi picchi possono essere attribuiti agli zuccheri prodotti dal fiore diatomee nel microcosmo. In un esperimento simile a confronto la crescita delle comunità naturali plancton in acqua di mare artificiale o naturale, approcci statistici sale come principale trama analisi punteggio della componente (PCA) derivato da spettri NMR binned può essere usato per mostrare evidenti differenze metaboliche tra i due trattamenti (Fig. 2), mentre le trame possono identificare i picchi di carico all'interno del spettri che forma la distribuzione dei dati . Tali risultati possono essere confrontati con i dati provenienti da altri livelli omiche, come da metodi di fingerprinting genomici (Fig. 3). Questi picchi NMR può essere interrogato singolarmente (ad esempio presso l'BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) ^19, o spettri intera possono essere analizzati statisticamente (per esempio con SpinAssign a http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) ^2. In questo esempio, le differenze tra i trattamenti erano dovuti ad un abbondanza di picchi nella regione di zuccheri (3,39 ppm a 4,04 ppm) degli spettri di metaboliti naturali della comunità plancton, e numerosi picchi caratteristici delle comunità artificiali con acqua di mare sono stati provvisoriamente identified come lattato e formiato con SpinAssign.

Figura 1. Rappresentativa spettri ¹ H NMR ottenuti da campioni trattati con questa procedura. I campioni sono stati prelevati prima del Microcosmo (giorno 1) e durante (giorno 4) una fioritura di diatomee intenso. Esperimenti NMR sono state eseguite su uno strumento Bruker DRX-500 con segnali normalizzati al altezza picco dello standard interno (DSS; 0 ppm).

Figura 2. Analisi delle componenti principale (PCA) plot punteggio spettri NMR cestinate da metabolomes delle comunità microbiche naturalmente derivati ​​planctonici coltivate in microcosmi con diamanti naturali (acqua di mare aperto) o artificiali (cerchi neri). Chiare differenze metaboliche può essere osservato nel grafico a dispersione. Una trama caricamento da una tale analisi può essere utilizzato per identificare picchi distinti di importanzail sistema, questi picchi può essere ulteriormente analizzato come necessario.

Figura 3. Un esempio di multi-omiche analisi NMR combinazione con i dati genomici. Composizione della comunità sulla base di elettroforesi su gel gradiente denaturante 18S (a sinistra) e 16S (a destra) geni rRNA dai campioni stessi analizzati nella Figura 2 mostra anche diversi modelli di comunità microbiche tra i diamanti naturali (aperti) e artificiale (cerchi neri) microcosmi di acqua di mare. Tale corrispondenza tra metaboloma genoma e dai sistemi naturali dimostra l'utilità di questo approccio.

L'estrazione filtrazione e metabolita metodo illustrato qui permette per la biomassa microbica planctoniche da raccogliere in quantità sufficiente per metabolomica NMR. Mentre solo di estrazione acquosa-solubili metaboliti utilizzando KPI e 1D ¹ H NMR è dimostrata, altri solventi da estrazione e approcci spettroscopici possono essere utilizzati. Un esempio utile è l'uso di metanolo deuterato come solvente semi-polare, che ha dimostrato di produrre spettri NMR superiore da campioni eterogenei ed è meno sensibile alla contaminazione da ioni paramagnetici, come si trovano in campioni marini ^15. In tali casi, il pellet dall'estrazione sopra dovrebbe essere mantenuta per successive estrazioni. Il nostro lavoro precedente ha mostrato la stabilità degli spettri in questi tempi di incubazione e le temperature e l'idoneità di diretta estrazione acquosa per la spettroscopia NMR ^15,20. Tuttavia i ricercatori possono anche preferire di modificare le fasi di estrazione, ad esempio utilizzando un Denapasso ristrutturazione per inattivare gli enzimi prima dell'estrazione, o mediante rapida dissetanti metodi diversi dalla semplice congelamento delle cellule come qui mostrato. Inoltre, mentre i metodi qui presentati sono più adatti per osservare variazioni proporzionali in metaboliti attraverso trattamenti, se desiderato, i filtri possono essere pre-pesato e poi nuovamente pesato dopo filtrazione del campione e liofilizzazione per ottenere peso secco, o il volume di campione filtrato può essere utilizzato per ottenere maggiori quantitativi dati di origine metaboliti.

In definitiva, l'utilità di NMR per campioni planctonici è limitata dalla quantità di massa che può essere con successo raccogliere; anche ad alta densità colture può richiedere grandi quantità (> 100 ml) per ottenere sufficiente biomassa secca. Tuttavia, all'interno di un quadro sperimentale, l'etichettatura isotopo stabile negli esperimenti di micro-o mesocosmo, 2D ^{1 H-13} C eteronucleari singoli coerenza quantistica (HSQC) gli approcci sono possibili. Inoltre, abbiamo inoltre utilizzato 47 -filtri mm e da 5 ml tubi in polipropilene per aumentare la quantità di biomassa che può essere raccolto per l'estrazione, poiché i volumi ancora più grandi può essere necessario (vale a dire> 2 L) per le comunità naturali, come ad esempio le acque oligotrofiche dove la densità delle cellule sono bassi.

La filtrazione è vantaggioso rispetto centrifugazione in quanto è la nostra osservazione che alcuni taxa microbica più piccolo (batteri eterotrofi in particolare le piccole) spesso non lo fanno pellet bene. La filtrazione può essere eseguita manualmente nel campo, ed i volumi filtrati sono limitate soltanto dal numero di filtri disponibili. Inoltre, supporti in eccesso o acqua può essere rimossa in questo modo, ed i campioni possono essere risciacquati se necessario. Naturalmente, anche con filtrazione, la comunità raccolto sarà limitata ad una frazione dimensione fino al taglio del filtro, che in questo esempio è 0,22 pm.