La concentración de los metabolitos de las comunidades planctónicas de baja densidad para la metabolómica ambiental utilizando espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

1. Preparación del filtro para eliminar extraíbles

1. Utilizar 25-mm de diámetro de 0,22 micras de tamaño de poro Durapore filtros hidrófilos PVDF (Millipore). Poner el filtro en un vaso de precipitados limpio de 500 ml Pyrex usando unas pinzas. Pre-enjuague tres veces con agua destilada. Agitar bien como enjuague para evitar que los filtros se peguen entre sí. Añadir 300 ml de Milli-Q (Millipore) o agua equivalente de alta calidad. Autoclave para facilitar la eliminación completa de extraíbles de los filtros.
2. Vierta el Milli-Q y otra triple lavado de los filtros, esta vez con Milli-Q. El uso de filtros pinzas lugar individuales en una superficie limpia y seca (tal como papel de aluminio) y, o bien seco a una temperatura razonable (por ejemplo 37 ° C) o aire seco. Los filtros están ahora listos para usar.

2. La filtración del material de muestra

1. Para demostrar este protocolo, un acero inoxidable de 3-Millipore lugar colector del filtro con las columnas de microanálisis de filtro de 25 mm con soportes de vidrioy una bomba mecánica se utilizan. Utilizando una técnica aséptica, colocar un único 25-mm de filtro en la base de la columna filtro, aplicar la columna y la abrazadera juntas.
2. Coloque 15 ml de muestra a la columna, abra la válvula de cierre en el colector del filtro, y encienda la bomba. Filtrar bajo una suave presión para minimizar la rotura de células (<5 kPa). Otras bombas, tales como la mano o una bomba peristáltica puede ser adaptado a este protocolo. Para muestras de menor densidad, adiciones sucesivas de agua puede ser necesario, no deje pasar el filtro seco durante un período prolongado de tiempo entre adiciones de agua.
3. Para las muestras marinas, después de haber filtrado la muestra, usted puede realizar un enjuague de agua dulce opción para reducir los iones paramagnéticos residuales en la muestra y en el filtro. Esto puede ayudar con una afinación más precisa del imán del espectrómetro. Simplemente agregue suavemente una pequeña cantidad de agua y filtrar a través de su muestra recogida al final.
4. Una vez filtrado se termine, apague la bomba, y salir de la opa de la válvulan lo que todavía hay una presión negativa en el filtro. Retire la abrazadera y la columna del filtro.
5. Con una mano, utilice pinzas limpias para apoderarse de el filtro. Doble el filtro en sí mismo, pero no se pliegue. Con la otra mano utilizar el borde de un tubo estéril de microcentrífuga de 2 ml para sujetar el filtro. Suelte las pinzas luego usarlas para volver a agarrar ambos lados del filtro. Regrip en un ángulo de 45 ° al redil.
6. Coloque el filtro en el tubo de 2 ml y la liberación por lo que se abre con la cara mirando hacia dentro de la muestra. Usted puede colocar un máximo de dos filtros en el tubo de microcentrífuga estéril 2 ml de esta manera. Si se usan dos filtros, asegurar que se solapan tan poco como sea posible. Congelar de inmediato (al menos a -30 ° C).

3. Extracción de acuoso solubles Metabolitos

1. Liofilizar las muestras durante la noche o por lo menos 10 horas.
2. Después de la liofilización, añadir una trituradora de acero inoxidable a cada tubo (Tokken). Añadir 750 l de potasio estandarizadatampón de fosfato de RMN en óxido de deuterio ⁽² H> 90%) con 2,2-Dimetil-2-silapentane-5-sulfonato (DSS) estándar (KPI; 38,3 mM de KH ₂ PO _4, 61,7 mM K ₂ HPO _4, 0,1 DSS mM, pH 7,0, 90% de D ₂ O) ^2.
3. Soníquelos las muestras durante 5 minutos a 4 ° C en un sonicador de agua (Bioruptor, Diagenode) para eliminar el material celular del filtro. Retire los filtros con pinzas limpias.
4. Romper las células utilizando un molino triturador (1600 rpm) durante 5 minutos.
5. Incubar a 65 ° C con agitación (1400 rpm) en un agitador de banco superior (Eppendorf) durante 15 minutos.
6. Retirar el cerdo de metal con pinzas limpias, y centrifugar la muestra a 13.000 g durante 5 minutos.
7. Extraer el sobrenadante directamente a un tubo de RMN para espectroscopía de RMN.

4. Espectroscopia de RMN y análisis de datos

1. Cargue la muestra en un espectrómetro de RMN (en este caso, un Bruker DRX-500 equipado con espectrómetro deTXI sonda con tres ejes de gradiente controlado por un equipo que ejecuta XWIN-RMN).
2. Obtener 1D ¹ H espectros de RMN mediante métodos adecuados previamente publicados ^2,15 desde la interfaz XWIN-RMN. En el presente estudio ¹ H espectros de RMN se registraron en un espectrómetro de funcionamiento DRX-500 a 500,03 MHz a 298 señales de agua K. residuales fueron suprimidas por la secuencia de pulsos de Watergate, con un tiempo de repetición de 1,2 s. 128 transitorios se recogieron para obtener 32.000 puntos de datos por espectro.
3. Transferencia de los directorios de datos de RMN a un PC instalado el software NMRPipe ^16. Procesar los datos en bruto y DSS conjunto como 0 ppm referencia a continuación, eliminar manualmente los espectros. Digitalizar los datos espectrales en un conjunto de valores discretos mediante la integración o "hurgar en la basura" con un software como rNMR, Automics, o utilizando el paquete FT2B a disposición del público en el sitio web eComics ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) ^3,17. En ªes un ejemplo, los espectros se integraron entre 0,5 y 10,5 ppm en 0.032 ppm regiones integrales utilizando eComics y normalizadas a cualquiera de DSS o la intensidad de la señal total. Los datos de salida ahora se puede utilizar para el análisis estadístico de aguas abajo, tales como análisis de componentes principales (ACP) con paquetes de software libre como el R ^18.

5. Los resultados representativos

Un ejemplo de ¹ H espectros de RMN obtenidos utilizando los métodos anteriores se muestran en la Figura 1. Estas muestras, a partir de dos puntos de tiempo de un experimento de microcosmos muestran claras diferencias debido a las actividades metabólicas de algas. El día 4 espectro muestra considerable abundancia de picos, particularmente en el intervalo de 3-4 ppm en comparación con el día 1 muestra. Estos picos se puede atribuir a los azúcares producidos por la floración de diatomeas en el microcosmos. En un experimento similar comparando el crecimiento de las comunidades de plancton natural en agua de mar artificial o natural, aproximaciones estadísticas sUCH como trama principal de análisis de componentes puntuación (PCA) derivado de espectros de RMN binned se puede utilizar para mostrar claras diferencias metabólicas entre los dos tratamientos (Fig. 2), mientras que las parcelas de carga puede identificar los picos en el espectro de que la forma de la distribución de los datos . Estos resultados pueden compararse con los datos de los niveles ómicas otros, tales como métodos de huellas genómicas (Fig. 3). Estos picos de RMN se pueden consultar de forma individual (por ejemplo, en el BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) ^19, o los espectros de todo pueden ser analizados estadísticamente (por ejemplo, con SpinAssign en http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) ^2. En este ejemplo, las diferencias entre los tratamientos se debieron a una gran cantidad de picos en la región de los azúcares (3,39 ppm a 4,04 ppm) de los espectros de metabolitos naturales de la comunidad de plancton, y varios picos característicos de las comunidades de agua de mar fueron tentativamente identified como lactato y formiato utilizando SpinAssign.

Figura 1. Representante ¹ H espectros de RMN obtenidos de las muestras procesadas usando este procedimiento. Las muestras fueron tomadas antes de microcosmos (día 1) y durante (día 4) un intenso florecimiento de diatomeas. Experimentos de RMN se realizaron en un espectrómetro Bruker DRX-500 con las señales normalizadas a la altura del pico de patrón interno (DSS; 0 ppm).

Figura 2. Análisis de Componentes Principales (PCA) parcela puntuación de los espectros de RMN de metabolomes desechado de forma natural derivados de las comunidades microbianas planctónicas cultivadas en microcosmos con natural (rombos abiertos) o agua de mar artificiales (círculos negros). Hay claras diferencias metabólicas se puede observar en el diagrama de dispersión. Un diagrama de carga de este tipo de análisis a continuación, se puede utilizar para identificar picos distintos de importancia enel sistema; estos picos pueden ser analizadas según sea necesario.

Figura 3. Un ejemplo de multi-ómicas análisis RMN combinando con los datos genómicos. Composición de la comunidad basada en electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante del 18S (izquierda) y 16S (derecha), los genes rRNA de las mismas muestras que se analizan en la figura 2 también muestra distintos patrones de las comunidades microbianas naturales entre (rombos abiertos) y microcosmos de agua de mar artificiales (círculos negros). Esta correspondencia entre el metaboloma y el genoma de los sistemas naturales demuestra la utilidad de este enfoque.

El método de extracción de filtración y el metabolito ha demostrado aquí permite la biomasa planctónica microbiana que debe recogerse en cantidad suficiente para la metabolómica RMN. Mientras que la extracción acuosa de sólo solubles en metabolitos utilizando KPI y 1D ¹ H RMN se demuestra, otros disolventes de extracción y enfoques espectroscópicos se puede utilizar. Un ejemplo útil es el uso de metanol deuterado como disolvente semipolar, que se ha demostrado para producir espectros de RMN superior de muestras heterogéneas y es menos sensible a la contaminación por iones paramagnéticos como se encuentran en muestras marinas ^15. En tales casos, el sedimento de la extracción anterior deben ser conservadas para extracciones sucesivas. Nuestro trabajo previo ha demostrado la estabilidad de los espectros en estos tiempos de incubación y las temperaturas y la adecuación de la extracción directa acuosa para la espectroscopía de RMN ^15,20. Sin embargo los investigadores también pueden preferir para modificar etapas de extracción, por ejemplo utilizando un DenaTuring paso para inactivar enzimas antes de la extracción, o mediante un rápido enfriamiento-métodos que difieren de simplemente congelación de las células como se muestra aquí. Además, mientras que los métodos presentados aquí son los más adecuados para la observación de los cambios proporcionales en metabolitos a través de tratamientos, si se desea, los filtros pueden ser pre-pesaron y luego se pesan de nuevo después de la filtración de la muestra y liofilización para obtener el peso seco, o el volumen de muestra filtrada puede ser utiliza para obtener datos más cuantitativos de metabolitos de origen.

En última instancia, la utilidad de la RMN para muestras planctónicas se ve limitada por la cantidad de masa que puede ser recogido con éxito; incluso cultivos de alta densidad pueden requerir grandes volúmenes (> 100 ml) para obtener suficiente biomasa seca. Sin embargo, dentro de un marco experimental, el etiquetado, los isótopos estables en los experimentos de micro o meso-cosmos, 2D ^{1 H-13} C heteronucleares individuales coherencia cuántica (HSQC) enfoques son posibles. Además, hemos utilizado adicionalmente 47 -filtros mm y de 5 ml tubos de polipropileno para aumentar la cantidad de biomasa que puede ser recolectada para la extracción, ya que los volúmenes aún mayores puede ser necesario (es decir,> 2 litros) para las comunidades naturales de aguas oligotróficas, por ejemplo, donde las densidades celulares son bajas.

La filtración es ventajoso con respecto a la centrifugación, ya que es nuestra observación de que algunos taxones microbianos más pequeños (bacterias heterotróficas en particular los pequeños) a menudo no lo hacen así de pellets. La filtración puede realizarse manualmente en el campo, y los volúmenes filtrados están limitadas sólo por el número de filtros disponibles. Además, el exceso de material o agua se puede eliminar de esta manera, y las muestras se puede enjuagar si es necesario. Por supuesto, incluso con la filtración, la comunidad recogida se limita a una fracción de tamaño hasta el corte del filtro, que en este ejemplo es de 0,22 micras.