G 단백질 결합 수용체에 작용제 활동 Quantifying

1. 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정 : 없음 제정 활동

1. 상대 작용제 K _{B 값의} 추정 (RA _I)에 대한, 적어도 두 작용제 농도 - 반응 곡선의 연속이 필요합니다. GPCR의 기능 반응에 대한 시험 관내 분석의 모든이 작용제의 농도가 제어 및 수용체 mediates의 단일 유형의 응답 수를 제공 측정할 수 있습니다. 적합 셀 기반 assays 캠프 ^4,7의 측정 및 재조합 수용체를 표현하는 세포 라인 inositolphosphate 축적 ^8,9를 포함합니다. 전체 조직 assays의 예는 평활근 ¹⁰ M ₂ muscarinic 수용체와 아트리움 ¹¹ 왼쪽 필드 자극 쥐 수축에 β ₁ - adrenoceptor - 중재 변경 수축의 측정을 포함합니다.
2. 매우 효과 작용제를 포함하여 분석을 위해 agonists 일련의 선택(예 : 내생 리간드). 주어진 실험에서 각 작용제에 대한 전체 농도 - 반응 곡선을 측정합니다. agonists의 수가 한 실험에서 분석을 완료하려면 너무 큰 경우 subgroups, 하나의 실험 agonists의 관리 번호로 구성된 각에 agonists를 나눕니다. 각 하급 집단 들어, (그림 3 참조) 하급 집단에있는 다른 agonists 분들과 함께 높은 효과 작용제의 농도 - 반응 곡선을 측정합니다. 6 회, 약, 데이터의 다양성에 따라 - 각 하급 집단 3에 대한 실험을 반복합니다.
3. 각각의 농도 - 반응 곡선을 보려면 작용제의 부재 (기저 응답)의 응답을 측정하고, 작용제의 농도 증가의 존재 인치 우주 균일하게 로그 크기마다 약 0.3에서 작용제의 농도 - 0.7 로그 ₁₀ 대, 응답의 범위를 덮고 있으며 최대한의 응답 (E _최대) (그림 3 참조) 정의. experim에 대한세포 라인에 대한 엔트는 각 측정 세중의에 수행됩니다.
4. 작용제의 각 농도의 면전에서 측정되는 기초에서 응답을 빼기. 응답 그림 3에 꾸몄다는 이러한 방식으로 계산했다.

2. 작용제 농도 - 반응 곡선의 예비 분석 : 없음 제정 활동

1. 프리즘에 데이터 테이블에 농도 - 반응 실험 (예를 들어, 그림 5)에서 데이터를 입력합니다. 로그 작용제의 농도는 모두 가장 큰 전자 _최대 가치를 갖고 나타나는 작용제에 대한 응답 측정이 칼럼에 입력하고 있으며, 다른 작용제 분들이 옆에 글자를 컬럼에 입력됩니다 X. 표시된 열 아래 입력합니다. 농도 - 반응 곡선의 복제 성능은 주어진 글자를 열의 하위 컬럼에 입력됩니다.
2. 데이터가 역모중인 그래프 시트를 선택하고 사용하여 비선형 회귀 분석하여 데이터를 분석방정식이받을 로그 (작용제) 대 응답 - 가변 슬로프 (4 매개 변수). 0으로 "히프"매개 변수를 제한하고, 회귀 분석을 수행합니다. (E _최대)의 "상위"를 복사하여 초기 매개 변수 견적의 계산에 사용하기 위해 Excel 스프레드 시트로 EC ₅₀ 매개 변수를 기록합니다. 다른 agonists는 "테스트 agonists"로 지정되어 있습니다 반면, 가장 큰 전자 _최대 추정치와 작용제는 "표준 작용제"로 지정되어 있습니다.
3. 표준 작용제 (- 로그 EC ₅₀ ')의 부정 로그 EC ₅₀ 값이 _obs 로그 τK의 초기 추정치 (LOGR1)를 계산합니다.
   
   로그로 로그 RA 각 테스트 작용제의 _전 값 (LOGRA)의 초기 추정치를 계산 {(상단 * EC ₅₀ ') / (상위'* EC _{50 개)}} 표준 작용제의 매개 변수가 아포 스트로피로 표시된하는, .
   
   로그 친화 죄수를 계산해당 EC ₅₀ 가치의 부정 로그로 - 테스트 agonists의 stants (LOGK5 LOGK2).

3. 비선형 회귀 분석을 사용하여 작용제 라이 값 추정 : 없음 제정 활동

1. 2.1 이하 위에 설명된대로 프리즘의 데이터 테이블에 데이터를 입력합니다. 표준 작용제에 대한 데이터가 A 열에 입력되어 있는지 확인
2. 다섯 agonists 총 관련된 사건에 대한 그림과 같이 사용자 정의 방정식을 입력 여러 라인에 프리즘으로, "RAI 로그"
   • <a>에서 P = LOGK1
   • <a>에서 Q = LOGR
   • <~> Q = LOGR + LOGRA
   • <B> P = LOGK2
   • <C> P = LOGK3
   • <D> P = LOGK4
   • <E> P = LOGK5
   • Y = Msys / (1 + {[(1 10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
3. 다음과 같이 초기 매개 변수 추정을 입력하십시오 :
   표준 작용제의 로그 친화 상수 (LOGK1)에 대한 0 임의로 낮은 값을 입력합니다.
   
   의 초기 평가를 입력하세요LOGR과 친화 상수 (LOGK2 - LOGK5) 시험 agonists와 로그 라이 값 (LOGRA).
   
   변환기의 기울기 계수 (M) 1.0의 값을 초기 예상을 지정합니다.
   
   시스템의 최대한의 응답 (Msys) 표준 작용제 (상단 ')의 전자 _최대에 해당하는 값을 초기 견적을 지정합니다.
4. ; LOGR1, Msys와 M, 모든 데이터 집합에 대한 공유 가치, - LOGK5 및 LOGRA없고 제약 LOGK2 LOGK1 상수, 0으로 제약이있는 다음 매개 변수 제약 조건을 적용합니다.
5. 비선형 회귀 분석을 시작합니다. 결과는 _obs 로그 K를 얻을 수 있고 시험 agonists의 로그 RA _I 값. 표준 작용제가 가득 작용제있다면, 로그 K 모두 _obs 및 로그 RA _{I 값이} 정확하고 있습니다. 가장 효과 작용제 (표준 작용제)는 다음 실제로 K 부분 작용제 경우 _obs 더 효과 AG의 가치onists는 과대 평가 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 로그 RA의 _견적이 상황에서 아직도 정확하고 있습니다.
6. 회귀가 수렴하지 않는 경우, 실험자은 초기 매개 변수 추정에 의해 정의된 이론 곡선을 계획하실 수 있습니다. 데이터 포인트와 이론적 곡선 사이에 큰 편차가있다면, 초기 매개 변수 견적의 계산을 확인합니다. 하나 이상의 agonists 전자 _맥스가 표준 작용제의에 해당하는 값이있다면, 그것은 _obs 회귀를 위해 0으로 값이 솔루션을 추적하기 위해 로그 K를 제한해야 할 수도 있습니다.

4. 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정 셀 기반 assays에서 제정 수용체​​ 활동을 전시

1. M ^-1, 세포가 체외 기반의 assays에 전시 제정 수용체 활동을 사용하는 절대 단위로 작용제 K _B의 값을 추정하십시오. Constitutive 수용체 활동이 관심의 수용체 표현에 의한 기초 수준 이상 반응의 증가로 정의됩니다.
2. agonists를 선택하고 섹션 1.2에서 위에서 설명한 실험을 설계.
3. 각각의 농도 - 반응 곡선 들어, 비 transfected 세포의 작용제의 부재 (기초 반응) 및 관심있는 수용체 (기초 반응 + 제정 응답)로 transfected 세포의 반응을 측정합니다. 섹션 1.3 위에 설명된대로 다른 agonists의 다른 농도의 존재에 응답을 측정합니다.
4. 제정 수용체​​ 활동 및 측정된 응답 마이너스 수용체와 transfected하지 세포 기저 응답으로 작용제의 각 농도에 대한 응답을 계산합니다. 그림 6은 매우 낮은 제정 활동을 전시 신호 경로를 위해 이러한 방식으로 계산된 여러 agonists에 대한 답변을 보여줍니다.

5. 예선작용제 농도 - 반응 곡선의 alysis이 제정 활동을 전시

1. 섹션 3.1에서 설명한뿐만 아니라 -20의 로그 작용제의 농도에 해당하는 적절한 글자 열에 제정 수용체​​의 활동에 의한 응답을 입력으로 프리즘의 데이터 테이블에있는 데이터 (예를 들어, 그림 6)를 입력합니다. 대형 부정 대수는 제로의 대략적인 작용제의 농도로 입력됩니다.
2. 섹션 2.2에서 위에서 설명한 있지만, "아래"매개 변수가되도록 제약과 마찬가지로 데이터 분석 "모든 데이터 집합에 대한 공유를." '상위'(E _최대), 공유 "아래"를 복사하여 초기 매개 변수 견적의 계산에 사용하기 위해 Excel 스프레드 시트에 EC50 매개 변수를 기록합니다.
3. 다음과 같이 초기 매개 변수 견적 계산 :
   
   이전 ^3에서 설명하는 것처럼 표준 작용제 (LOGK1) 또는 전체, 테스트 작용제의 상수 로그 선호도는 별도의 실험에서 결정되어야합니다
   로그의 초기 추정치를 계산 K _obs 로그 {(Top' - 톱) / (EC ₅₀ (Top' - 아래))} 각 부분의 테스트 작용제의 값 (즉,이 경우에만 LOGK2)하는 "아래에서 "제정 수용체​​ 활성화에 의한 반응은 나타냅니다.
   
   로그 각 작용제에 대한 로그 K _B (LOGKb)의 초기 추정치를 계산 {가기 / (EC ₅₀ 아래)}.
   
   로그로 로그 τ _치세요 (LOGTsys)의 초기 추정치를 계산 {하단 / (톱 '- 아래)}.

6. 비선형 회귀 분석을 사용하여 제정 수용체​​의 활동을 전시 응답 작용제의 KB 값 추정

1. 3.1 이하 위에 설명된대로 프리즘의 데이터 테이블에 데이터를 입력
2. 이 agonists의 상태에 대해 같이 사용자 정의 방정식을 입력 여러 라인에 프리즘으로, "KB 로그"
   • <a>에서 LOGKOBS = LOGK1
   • <B> LOGKOBS = LOGK2
   • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) 1
   • B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
3. 다음과 같이 초기 매개 변수 추정을 입력하십시오 :
   
   각 작용제의 친화 상수 (- 5.3 단계에 따라 결정된 값을 입력 LOGK1)를 입력합니다.
   
   _obs 각 테스트 작용제의 견적을 K를 입력하십시오.
   
   agonists의 KB 견적을 입력합니다.
   
   τ _치세요 (LOGTsys) 견적 로그 입력합니다.
   
   각각의 트랜스 듀서의 기울기 계수 (M)와 시스템의 최대한의 응답 (Msys) 1.0 및 상위 '(표준 작용제의 E _최대)의 값을 할당합니다.
4. ; LOGK2 및 LOGKb, 아니 제약 LOGTsys, Msys와 M, 모든 데이터 집합에 대한 공유 값 : 다음과 같은 매개 변수 제약 조건을 적용합니다.
5. 비선형 회귀 분석을 시작합니다. 결과는 표준 작용제의 로그 K _B, 로그 K _obs를 얻을 수 τ _{치세요 값} 및 운영 모델 (M)에서 변환기의 기울기 계수의 최대한의 반응의 로그 K _{B 값.}
6. 회귀가 수렴하지 않는 경우, 포인트 3.6 이하 위에 설명된 단계를 따르십시오.

7. 대표 결과

그림 5는 안정 M ₃ muscarinic 수용체 ¹² 표현 중국어 햄스터 난소 세포에서 muscarinic 작용제 유발 phosphoinositide 가수 분해에 대한 이전에 게시된 데이터의 일부를 보여줍니다. 선택된 muscarinic agonists의 농도 - 반응 곡선이 분석에서 측정되었습니다. oxotremorine - M의 상대, 각 작용제의 K _{B 값을} 추정 제 3 절 아래에서 위의 표현 설명된대로 데이터를 분석했다. areco, 이러한 로그 RA _{제가 견적,} carbachol, -0.56 ± 0.063 아르라인, -0.60 ± 0.074, pilocarpine, -1.20 ± 0.15, 그리고 McN - A - 343, -1.92 ± 0.31. 이론 곡선은 데이터 (섹션 3.2)로 회귀 방정식의 최소 제곱 적합을 나타냅니다. 시스템의 최대 응답 (M _{치세요)와} 변환기의 기울기 계수 (M)의 해당 견적은 53.9 ± 1.3 및 1.15 ± 0.09, 각각 있었다. 로그 K _obs oxotremorine - M의 경우를 제외하고 agonists의 가치가 있었다 carbachol, 5.19 ± 0.14, arecoline, 5.49 ± 0.12, pilocarpine, 5.58 ± 0.16 및 McN - A - 343, 5.27 ± 0.33.

그림 6은 안정 G _α15 ³ 표현 HEK 293 세포에 muscarinic 작용제 자극 phosphoinositide 가수 분해에 대한 실험의 결과를 보여줍니다. M ₃ muscarinic 수용체의 과도 표현 제정 수용체 activ에 기인되었다 기저 phosphoinositide 가수 분해, 증가의 원인ity. 데이터는 제 6 항 아래에 설명되어있는대로 oxotremorine - M 및 McN - A - 343의 로그 K _{B 값을} 추정하기 위해 분석되었다. 이 분석은 각각 oxotremorine - M 및 McN - A - 343에 대한 8.30의 로그 K _{B 값} ± 0.59 및 6.59 ± 0.77이 나왔고. 이론 곡선은 데이터에 회귀 방정식의 최소 제곱 적합 (제 6.2 참조)를 나타냅니다. 로그인 τ _치세요, M _치세요과 M의 추정은 -2.29 ± 0.59, 95.8 ± 2.8 및 0.72 ± 0.08, 각각 있었다. K의 예상 _obs McN - A - 343의 가치는 5.35 ± 0.46했다.

그림 1. 단일 수용체 활동 및 수용체 인구의 활성화의 평균 수준 간의 관계. 단일 수용체 활동, transitio를 겪고 단일 수용체의 이론적인 행동작용제의 존재에서 활약 사이 NS (ON) 및 비활성 (OFF) 상태는 표시됩니다. 활성 및 비활성 상태에 대한 작용제의 친화 상수는 각각 K _B와 K으로 표시됩니다. 인구 행동 작용제의 존재에 활성 및 비활성 상태 사이의 임의의 전환을 진행하는 여러 수용체의 이론적인 행동. 인구 보여집니다 평균은 작용제의 특정 농도의 존재에 수용체의 인구 수용체 활성화의 평균 수준 표시됩니다. 수용체 인구의 활성화 수준은 자극으로 알려져 있습니다.

그림 2. 수용체 활성화 기능과 효능 (ε)과 작용제. 인구 평균 관찰 친화 상수 (K _obs) 사이의 관계의 평균 수준수용체 활성화 작용제의 농도를 증가 것은 표시 의해 elicited. 수용체 활성화를 수용체 활성화의 평균 수준은 작용제 작용제의 로그 농도 꾸몄다입니다. 절반 최대한의 수용체 활성화에 필요한 작용제의 부정 로그 농도는 작용제 (로그 K _obs)의 지속적인 로그 관찰 친화력하는 것과 동일합니다. 수용체 활성화 함수의 최대 효능 (ε)로 표시된 것입니다.

그림 3. 인간 M ₃ muscarinic 수용체를 표현 중국어 햄스터 난소 세포의 다양한 muscarinic agonists에 의한 ^[3 H] inositolphosphate 축적의 자극에 대한 농도 - 반응 곡선의 예. 구 작용제 농도 - 반응 곡선의 총 측정되었습니다. 실험은 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 각 부분 들어, 표준 작용제 (oxotremorinEM)은 언제나 추가 agonists와 함께 테스트됩니다. 따라서, 표시 유형의 두 실험은 A와 B 겨우 다섯 agonists는 한번에 assayed 수있다면 구 agonists의 농도 - 반응 곡선을 측정해야합니다. 데이터 Ehlert 외에서 있습니다. ^12.

그림 4. _인간이 muscarinic 수용체 M과 G _α15을 표현하는 HEK 293 세포에서 다양한 muscarinic agonists에 의한 ^[3 H] inositolphosphate 축적의 자극에 대한 농도 - 반응 곡선의 예. M ₂ 수용체 표현 30을 일으킨 - 제정 수용체의 활동에 기인했다 35% ^[3 H] inositolphosphate 응답. 데이터 Ehlert 외에서 있습니다. ^12.

그림 5. 3 muscarinic 수용체를 표현. 자극 phosphoinositide 가수 분해에 대해 선택한 muscarinic agonists의 농도 - 반응 곡선이 표시됩니다. 세 실험에서 값을 평균 ± SEM이 표시됩니다. 데이터 Ehlert 외에서 있습니다. ^12.

그림 6. Oxotremorine - M과 G _α15 및 M ₃ muscarinic 수용체를 표현하는 HEK 293 세포에 McN - A - 343 - 중재 phosphoinositide 가수 분해. Phosphoinositide 가수 분해는 oxotremorine - M의 전자 _최대에 상대적으로 표시됩니다. 작용제의 부재에서 phosphoinositide 가수 분해는 M ₃ 수용체 응답의 약 2 %를 차지한다 표현에 기인. 세 실험 ± SEM의 수단이 표시됩니다. DATA는 Ehlert 외에서 있습니다. ^3.

RA _I (상대 K _{B 값)을} 계산하는 우리의 방법은 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정을 필요로하기 때문에이 곡선이 측정 언제든지, 우리의 분석을 할 수 있습니다.

실험 준비 (예 : 세포 또는 조직)의 응답에 매일 변동이 큰 경우, 각각의 농도 - 반응 곡선의 응답 성능은의 표준 작용제의 "상위"추정 상대적 정상화 수있는 매일 매일의 실험. 상위 및 로그 EC ₅₀ 예상대로 섹션 2와 5에서 설명하는 회귀 분석에 의해 표준 작용제의 각 복제 농도 - 반응 곡선에 대한 추정된다. 주어진 하루에 작용제 농도 - 반응 곡선의 모든 응답 값이 그날의 표준 작용제의 상위 평가에 상대적으로 정상화됩니다. beginn 위에서 설명한대로 이러한 정규화된 데이터는 분석 아르제 3 ING.

K _B를 추정의 정확도가 제정 수용체 활동의 정확한 평가에 따라 달라집니다. 우리의 경우, HEK 293 세포에있는 M ₃ 수용체의 transfection은 약 500에서 원거리 phosphoinositide 가수 분해의 증가가 발생 - 세포에서 리튬의 존재로 측정 ^[3 H] inositolphosphates 1,000 노출당 비용 (CPM)를 미리 표시 [3H] 이노시톨과 . carbachol에 대한 최대한의 반응은 약 50,000되었습니다 - 60,000 노출당 비용 (CPM). 제정 응답, oxotremorine - M 및 McN - A - 343의 K _{B 값을} 우리의 예상을 크게하고 적은 변수 있었다 더 정확하게되었을 것입니다. K _B의 추정은 또한 운영 모델에서 변환기의 기울기 계수 (M)의 정확한 견적을 필요에 따라 달라집니다. 섹션 1.3에 따라 권장하는대로 작용제의 농도가 더 붙어있다면 그 결과,보다 정확도가 달성되었을 수 있습니다. Runni실험에 NG 추가 agonists는 크게 K _B의 따라서 M의 추정의 정확도를 증가합니다.

다른 커플링 단백질 (예, G 단백질)를 통해 신호가 다음, 분석의 방법은 작용제 K _B와 RA의 정확한 평가를 제공하는 수용체의 다양한 활성 _{상태가있다면 각각의} 이펙터 경로 ^3,6의 값을. 하나 이상의 활성 상태가 단일 측정 응답에 기여한다면, RA _I와 K _B의 추정 우리의 방법은 그들의 상대적인 풍요로움과 활동 ^3에 따라 다른 활성 상태의 가중 평균을 나타냅니다.

제정 수용체 활동은 GPCR과 보완 G 단백질 ¹³ 표현 이상으로 유도된 수 있습니다. 이것은 관찰 친화력과 작용제 - 수용체 복합의 효험을 변경할 수 있으며, 비 P가 발생할 수 있습니다hysiological 신호. 그러나 응답의 성격 변화와 수용체 인구의 관찰 친화력과 효능은 수용체의 기본 quantal 미국의 변화, 오직 자신의 번호에 변화와 이성 질화의 가능성을 암시하지 않습니다. 따라서 G 단백질 너무 수용체의 다른 이펙터 - 선택 상태에 창문으로 너무 많은 약물 효과의 결정자 없습니다. 작용제 바이어스의 궁극적인 측정 - 분석의 방법은 그것이 수용체의 이펙터 - 선택 상태에 대한 작용제 K _B 값을 측정할 수 있어야한다 (예, G 단백질) 단일 이펙터를 포함한 특정 GPCR 신호 assays에 적용하는 경우.