Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

1, 2, 3

1Department of Pharmacology, University of California, Irvine, 2Department of Pharmacology, University of California, 3Schmid College of Science, Chapman University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.234.231.49, User IP: 54.234.231.49, User IP Hex: 921364273

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).

Abstract: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

När en agonist aktiverar en population av G-protein-kopplade receptorer (GPCRs), framkallar det en signalväg som kulminerar i ett svar från de celler eller vävnader. Denna process kan analyseras på samma nivå som en enda receptor, en befolkning av receptorer, eller nedströms svar. Här beskriver vi hur man kan analysera nedströms svar för att få en uppskattning av agonist affinitet konstant för det aktiva tillståndet av enstaka receptorer.

Receptorer beter sig som quantal växlar som växlar mellan aktiva och inaktiva stater (Figur 1). Den aktiva staten interagerar med specifika G-proteiner eller andra signalsystem partner. I avsaknad av ligander, dominerar inaktiva tillstånd. Bindningen av agonist ökar sannolikheten för att receptorn växlar till aktivt läge eftersom dess affinitet konstant för det aktiva tillståndet (K b) är mycket större än för den inaktiva staten (K a). Den summering avslumpmässiga utgångar av alla de receptorer i befolkningen ger en konstant nivå av aktivering av receptorn i tid. Den ömsesidiga av koncentrationen av agonist utlösande halv-maximal aktivering av receptorn motsvarar den observerade affinitet konstant (K OBS), och andelen agonist-receptor komplex i den aktiva staten definieras som effekt (ε) (Figur 2).

Metoder för att analysera nedströms svar GPCRs har utvecklats som gör det möjligt för uppskattning av K-obs och relativa effekten av en agonist 1,2. I denna rapport visar vi hur du ändrar denna analys för att uppskatta agonist k B värde i förhållande till en annan agonist. För analyser som uppvisar konstituerande aktivitet visar vi hur man kan beräkna k B i absoluta enheter av M -1.

Vår metod för att analysera agonist koncentration-respons-kurvor 3,4 bestårav de globala icke-linjär regression med verksamhetsmodellen 5. Vi beskriver ett förfarande med hjälp av programmet, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analysen ger en uppskattning av produkten av K-obs och en parameter proportionell effekt (τ). Uppskattningen av τK obs av en agonist, delat med en annan, är ett relativt mått på K b (RA i) 6. För alla receptorn uppvisar konstitutiv aktivitet är det möjligt att skatta en parameter i proportion till effekten av den fria receptor komplex (τ sys). I det här fallet är K b värdet av en agonist motsvarande τK obs / τ SYS 3.

Vår metod är användbar för att bestämma selektiviteten hos en agonist för receptor subtyper och för att kvantifiera agonist-receptor signalering genom olika G-proteiner.

Protocol: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

1. Mätning av agonist koncentration-respons-kurvor: ingen konstitutiv aktivitet

  1. För skattning av relativ agonist K b värden (RA i), är en serie med minst två agonist koncentration-respons-kurvor krävs. Alla in vitro-test för den funktionella svar på en GPCR kan mätas förutsatt att koncentrationen av agonist kan kontrolleras och en enda typ av receptorer förmedlar svaret. Lämplig cellbaserade analyser inkluderar mätning av cAMP 4,7 och inositolphosphate ackumulering 8,9 i en cellinje som uttrycker en rekombinant-receptorn. Exempel på hela vävnaden analyser inkluderar mätning av sammandragning av glatt muskulatur 10 eller M 2 muskarin receptor-och β 1-adrenoceptor-medierade förändringar i sammandragning av fältet stimuleras råtta vänster förmak 11.
  2. Välj en serie av agonister för analys med en mycket effektiv agonist(T ex endogen ligand). I en viss experiment, mäta fullständig koncentration-respons-kurvor för varje agonist. Om antalet agonister är för stort för att slutföra analysen i ett enda experiment, dela agonister i undergrupper, vardera bestående av ett hanterbart antal agonister för ett enda experiment. För varje undergrupp, mäta koncentration-respons-kurva mycket effektiv agonist tillsammans med de övriga agonister i en subgrupp (se figur 3). Upprepa försöket för varje undergrupp 3 till 6 gånger, ungefär, beroende på variationer i data.
  3. För varje koncentration-respons-kurva, mäta respons i frånvaro av agonist (basal svar), och i närvaro av ökande koncentrationer av agonist. Utrymme agonist koncentrationer jämnt på en stock skala ca var 0,3 till 0,7 log 10 enheter, som omfattar utbud av svaren och definiera maximal respons (E max) (se figur 3). För experimmedelsingredienser på cellinjer är varje mätning görs i tre exemplar.
  4. Subtrahera basala svar från den som uppmättes i närvaro av varje koncentration av agonist. Svaren plottade i figur 3 beräknades på detta sätt.

2. Preliminär analys av agonist koncentration-respons-kurvor: ingen konstitutiv aktivitet

  1. Skriv in data från koncentration-respons-experiment (t.ex. figur 5) i en datatabell i Prism. Alla koncentrationer log agonist redovisas under kolumnen X. svar mätningar för agonist som verkar ha det största värdet E max ingås kolumn A, och som för de andra agonister förs in i angränsande lettered kolumner. Upprepade mätningar av en koncentration-respons-kurvor införs i sub-kolumner av en bokstav given kolumn.
  2. Välj grafen ark som uppgifterna ritas och analysera data genom icke-linjär regressionsanalys med hjälp avekvationen rätt, log (agonist) vs svar - Variabel lutning (fyra parametrar). Begränsa "Bottom" parametern till noll, och utföra regressionsanalys. Kopiera "toppen" (E max) och logga EG 50 parametrar i ett Excel-ark för att användas vid beräkning av första parameterskattningar. Det agonist med de största E max uppskattning betecknas som "standard agonist", medan de övriga agonister betecknas som "test-agonister".
  3. Beräkna den ursprungliga uppskattningen av log τK obs (LOGR1) som negativa log EG 50 standardserumets agonist (-log EG 50).

    Beräkna den första uppskattningen av loggen RA i värde för varje prov agonist (LOGRA) som log {(Top * EG 50 ') / (Top' * EC 50)}, där parametrar av standarden agonist betecknas med en apostrof .

    Beräkna log affinitet constants av testet agonister (LOGK2 - LOGK5) som negativ logg över sina respektive EC 50-värden.

3. Uppskattning av agonist Rai värden med hjälp av icke-linjär regressionsanalys: ingen konstitutiv aktivitet

  1. Mata in data i en datatabell i Prism som beskrivits ovan under 2.1. Se till att data för standard-agonist är införda i kolumn A.
  2. Ange en användardefinierad ekvation, "log Rai", i Prisma på flera linjer som visas för fallet med totalt fem agonister:
    • <A> P = LOGK1
    • <A> Q = LOGR
    • <~ A> Q = LOGR + LOGRA
    • <B> P = LOGK2
    • <C> P = LOGK3
    • <D> P = LOGK4
    • <E> P = LOGK5
    • Y = Msys / (1 + {[(en 10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
  3. Skriv in de första parameterskattningarna enligt följande:
    Skriv in ett godtyckligt låga värdet 0 för loggen affinitetskonstant (LOGK1) av standarden agonist.

    Skriv den första uppskattningen avLOGR och konstanter affinitet (LOGK2 - LOGK5) och logga RAI värden (LOGRA) av provet agonister.

    Tilldela den första uppskattningen av givarens backen (M) ett värde på 1,0.

    Tilldela den första uppskattningen för maximal respons av systemet (Msys) ett värde som motsvarar E max av standarden agonist (Top).
  4. Tillämpa följande parameter begränsningar: LOGK1 begränsas till konstant, 0, LOGR1, Msys och M delade värde för alla datamängder, LOGK2 - LOGK5 och LOGRA, inga begränsningar.
  5. Initiera icke-linjär regressionsanalys. Resultaten ger det log K obs och logga RA jag värden av testet agonister. Om standarden agonist är en full agonist, då både log K obs och logga RA i värden är korrekta. Om den mest effektiva agonist (standard agonist) är egentligen en partiell agonist, då K OBS värdena av de mer effektiva agonists kan vara överskattad. Trots de uppskattningar av log RA jag är fortfarande korrekta i denna situation.
  6. Om regressionen inte konvergerar, kan försöksledaren vill rita den teoretiska kurvan definieras av de första parameterskattningarna. Om det finns stora avvikelser mellan datapunkterna och den teoretiska kurvor, kontrollera beräkning av den initiala parameterskattningar. Om en eller flera agonister har E max värden som motsvarar standarden agonist, kan det vara nödvändigt att begränsa sina log K obs värden till 0 för regressionen närmar sig en lösning.

4. Mätning av agonist koncentration-respons-kurvor i cell-baserade analyser uppvisar konstitutiva receptoraktivitet

  1. För skattning av agonist K B-värden i absoluta enheter av M -1, cellbaserade in vitro-tester används som uppvisar konstitutiv receptoraktivitet. Grundlagentiva receptor aktivitet definieras som ökningen i svar över den basala nivån orsakas av uttrycket av receptorn av intresse.
  2. Välj agonister och design experimentet som beskrivs ovan i avsnitt 1.2.
  3. För varje koncentration-respons-kurva, mäta respons i frånvaro av agonist i icke-transfekterade celler (basal svar) och i celler transfekterade med receptorn av intresse (basala svar + konstitutiv svar). Mät svar i närvaro av olika koncentrationer av olika agonister som beskrivs ovan i avsnitt 1.3.
  4. Beräkna konstituerande receptoraktivitet och svaret på var koncentrationen av agonist som uppmätts svar minus basala reaktion i cellerna inte transfererats med receptorn. Figur 6 visar svaren på olika agonister beräknas på detta sätt för en signalväg uppvisar mycket låg konstitutiva aktivitet.

5. Preliminära enalysis av agonist koncentration-respons-kurvor uppvisar konstitutiva aktivitet

  1. Mata in data (t.ex. figur 6) i en datatabell i Prism som beskrivs i avsnitt 3.1, men också ange svaret som orsakas av konstitutiva receptor aktivitet i bokstäverna kolumnerna motsvarar en logg agonist koncentration av -20. En stor negativ logaritm är angett att närma en agonist koncentration av noll.
  2. Analysera data som beskrivs ovan i avsnitt 2.2, men med "Bottom"-parametern begränsas så att det är "delad för alla datamängder." Kopiera "Top" (E max), delat "Bottom" och logga EC50 parametrar i ett Excel-ark för att användas vid beräkning av första parameterskattningar.
  3. Beräkna den initiala parameterskattningarna enligt följande:

    Loggen affinitetskonstant av standarden agonist (LOGK1) eller fullt, testa agonist måste bestämmas i separata experiment som beskrivits tidigare 3
    Beräkna den första uppskattningen av log K obs värdet av varje partiell provning agonist (dvs endast LOGK2 i detta fall) som log {(Top'-Top) / (EG 50 (Top'-Bottom))}, där "Bottom "betecknar svar som orsakas av konstitutiv aktivering av receptorn.

    Beräkna den ursprungliga uppskattningen på log K b (LOGKb) för varje agonist som log {Top / (EG 50 längst ned)}.

    Beräkna den ursprungliga uppskattningen av log τ sys (LOGTsys) som log {Botten / (Topp '- Bottom)}.

6. Uppskattning av värden agonist Kb för svar uppvisar konstitutiva receptoraktivitet med icke-linjär regression analys

  1. Mata in data i en datatabell i Prism som beskrivs ovan under 3,1
  2. Ange en användardefinierad ekvationen "Logga Kb", i Prisma på flera linjer som visas för tillståndet i två agonister:
    • <A> LOGKOBS = LOGK1
    • <B> LOGKOBS = LOGK2
    • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) 1
    • B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB)
    • C = (10 ^ (LOGTSYS))
    • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
  3. Skriv in de första parameterskattningarna enligt följande:

    Skriv in affinitet konstanter för varje agonist (LOGK1 - ange det värde som fastställts enligt steg 5,3).

    Skriv in K obs uppskattningar av varje test-agonist.

    Skriv in Kb uppskattningar av agonister.

    Skriv in loggen τ sys (LOGTsys) uppskattning.

    Tilldela faktorn givaren backen (M) och maximal respons av systemet (Msys) värden på 1,0 och Top "(E max av standarden agonist), respektive.
  4. Tillämpa följande parameter begränsningar: LOGTsys, Msys och M delade värde för alla datamängder, LOGK2 och LOGKb, inga begränsningar.
  5. Initiera icke-linjär regressionsanalys. Resultaten ger det log K B i standarden agonist, log K obs K B-värden av partiella agonister, och maximal respons av systemet (Msys), den τ sys värdet för den fria receptor komplex (LOGTsys) och givaren lutning faktorn i den operativa modellen (M).
  6. Om regressionen inte konvergerar, följ stegen som beskrivs ovan under punkt 3.6.

7. Representativa resultat

Figur 5 visar några av våra tidigare publicerade data på muskarina agonist-inducerad phosphoinositide hydrolys i kinesiska hamsteräggceller stabilt uttrycka M 3 muskarina receptorn 12. Den koncentration-respons-kurvor av utvalda muskarina agonister mättes i denna analys. Uppgifterna analyserades som beskrivits ovan under avsnitt 3 för att beräkna k B värdet av varje agonist, uttryckt i förhållande till av oxotremorine-M. Dessa loggar RA i skattningarna, karbakol, -0,56 ± 0,063; Arecolinje, -0,60 ± 0,074, pilokarpin, -1,20 ± 0,15, och MCN-A-343, -1,92 ± 0,31. De teoretiska kurvorna representerar de minsta kvadratmetoden av regressionsekvationen till data (avsnitt 3.2). Motsvarande beräkningar av maximal respons av systemet (M sys) och givaren backen (M) var 53,9 ± 1,3 och 1,15 ± 0,09, respektive. De log K obs värden agonister, utom oxotremorine-M var karbakol, 5,19 ± 0,14, arecoline, 5,49 ± 0,12, pilokarpin, 5,58 ± 0,16 och MCN-A-343, 5,27 ± 0,33.

Figur 6 visar resultaten av experimenten på muskarina agonist-stimulerad phosphoinositide hydrolys i HEK 293 celler som stabilt uttrycker G α15 3. Övergående uttryck för M 3 muskarina receptorer orsakade en ökning i basal phosphoinositide hydrolys, som tillskrevs konstitutiva receptor verkIty. Uppgifterna analyserades för att uppskatta log K b värden oxotremorine-M och MCN-A-343 som beskrivs i avsnitt 6. Denna analys gav log K b värden på 8,30 ± 0,59 och 6,59 ± 0,77 för oxotremorine-M och MCN-A-343, respektive. De teoretiska kurvorna representerar de minsta kvadratmetoden av regressionsekvationen till data (se avsnitt 6.2). Uppskattningarna av log τ sys, M sys och M var -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 och 0,72 ± 0,08, respektive. Uppskattningen av K obs värdet på MCN-A-343 var 5,35 ± 0,46.

Figur 1
Figur 1. Förhållande mellan enstaka receptorer och den genomsnittliga nivån för aktivering av receptorn befolkningen. Singel receptorer, den teoretiska beteende av en enda receptor som genomgår Transitions mellan aktiva (på) och inaktiv (Av) anger i närvaro av en agonist visas. Den samhörighet konstanter agonist för den aktiva och inaktiva stater betecknas med K B och K ett, respektive. Befolkning beteende, den teoretiska hos en rad receptorer som genomgår slumpmässiga övergångar mellan aktiva och inaktiva stater i närvaro av en agonist visas. Befolkning genomsnitt är den genomsnittliga nivån för aktivering av receptorn i en population av receptorer i närvaro av en viss koncentration av agonist visas. Aktiveringen nivå receptorn befolkningen är känd som stimulans.

Figur 2
Figur 2. Förhållandet mellan aktivering av receptorn funktion och effekt (ε) och observerade affinitet konstant (K OBS) av agonist. Befolkning genomsnitt den genomsnittliga nivån föraktivering av receptorn som framkallades av ökande koncentrationer av agonist visas. aktivering av receptorn, är den genomsnittliga nivån för aktivering av receptorn ritas agonist loggen koncentrationen av agonist. Den negativa logga koncentration av agonist som krävs för halv-maximal aktivering av receptorn motsvarar loggen observerade affinitet konstant agonist (log K obs). Den högsta aktivering av receptorn fungerar betecknas effekt (ε).

Figur 3
Figur 3. Exempel på koncentration-respons-kurvor för stimulering av [3 H] inositolphosphate ackumulation av olika muskarina agonister i kinesiska hamsteräggceller uttrycka mänskliga M 3 muskarina receptorn. Sammanlagt nio agonist koncentration-respons-kurvor mättes. Experimentet kan delas upp i två delar. För varje del, standarden agonist (oxotremorinEM) är alltid testas tillsammans med ytterligare agonister. Således, A och B två experiment av det slag som visas i krävs för att mäta koncentration-respons kurvor av nio agonister om bara fem agonister kan analyseras samtidigt. Uppgifterna är från Ehlert et al. 12.

Figur 4
Figur 4. Exempel på koncentration-respons-kurvor för stimulering av [3 H] inositolphosphate ackumulation av olika muskarina agonister i HEK 293 celler som uttrycker den mänskliga M 2 muskarina receptorn och G α15. Redovisning av M 2-receptorn orsakade en 30 - 35% [3 H] inositolphosphate svar, som tillskrevs konstitutiva receptoraktivitet. Uppgifterna är från Ehlert et al. 12.

Figur 5
Figur 5. 3 muskarina receptorn. Koncentrationen-responskurvorna utvalda muskarina agonister för att stimulera phosphoinositide hydrolys visas. Medelvärden från tre experiment ± SEM visas. Uppgifterna är från Ehlert et al. 12.

Figur 6
Figur 6. Oxotremorine-M-och MCN-A-343-medierad phosphoinositide hydrolys i HEK 293 celler som uttrycker G α15 och M 3 muskarina receptorn. Phosphoinositide hydrolys uttrycks i förhållande till E-max oxotremorine-M. I avsaknad av agonist, tillskriven phosphoinositide hydrolys till uttryck av M 3-receptorn svarade för cirka 2% av svaret. Den hjälp av tre försök ± SEM visas. Den dATA är från Ehlert et al. 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

Eftersom vår metod för att uppskatta RA i (relativ K B-värdet) kräver endast mätning av agonist koncentration-respons-kurvor, kan vår analys göras när som helst dessa kurvor mäts.

Om dag till dag variation i svaret från den experimentella preparat (t.ex. celler eller vävnader) är stor, kan svaret mätningar av koncentration-respons-kurvan normaliseras i förhållande till "toppen" uppskattning av standard-agonist för varje dag experiment. En uppskattning av Top och logga EG 50 beräknas för varje replikat koncentration-respons-kurvan av standarden agonist med regressionsanalys som beskrivs i avsnitt 2 och 5. Svaret värden för alla agonist koncentration-respons-kurvor på en viss dag normaliseras i förhållande till Top uppskattning av standard-agonist för den dagen. Dessa normaliserade data analyseras sedan enligt ovan beginnning i avsnitt 3.

Noggrannheten för att skatta k B är beroende av en noggrann uppskattning av konstitutiva receptoraktivitet. I vårt fall orsakade transfektion av M 3-receptorn i HEK 293 celler en ökning phosphoinositide hydrolys som varierade från ca 500 - 1000 kopior av [3 H] inositolphosphates mäts i närvaro av litium i celler före märkta med [3H] inositol . Den maximala svar karbakol var cirka 50.000 - 60.000 kopior per minut. Hade konstitutiva svaret varit större och mindre varierande, vår uppskattning av k B värden oxotremorine-M och MCN-A-343 skulle ha varit mer korrekt. Uppskattningen av k B beror också på att ha en korrekt uppskattning av givarens backen (M) i den operativa modellen. Följaktligen kan större precision ha uppnåtts om de koncentrationer av agonist var mer tätt placerade som rekommenderas i avsnitt 1.3. Running ytterligare agonister i försöket också i hög grad ökar noggrannheten i uppskattningen av M, och därmed av K b.

Om det finns olika aktiva stater i receptor som signalen genom olika koppling proteiner (t ex G-proteiner), sedan vår analysmetod ger en rättvisande uppskattning av agonist K b och RA jag värden för varje effektor väg 3,6. Om mer än en aktiv status bidrar till en enda uppmätt respons, då vår metod för uppskattning av RA I och K b representerar ett vägt genomsnitt av olika aktiva stater beroende på deras relativa förekomst och aktivitet 3.

Konstituerande receptoraktivitet kan induceras med drygt uttrycka GPCR med kompletterande G-protein 13. Detta kan ändra den observerade affinitet och effekten av agonist-receptor komplex och kan orsaka icke-physiological signalering. Men förändringar i naturen av svaret och det observerade affinitet och effekten av receptorn befolkningen innebär inte förändringar i de grundläggande quantal staterna i receptorn, bara en förändring i deras antal och sannolikheten för isomeriseringsprocessen. Således, G proteiner är inte så mycket en bestämningsfaktor för läkemedelseffekter så mycket som ett fönster mot olika effektormedierad selektiv stater i receptorn. Om vår analysmetod tillämpas på specifika GPCR signalering testsystem med en enda effektor (t.ex. G-protein) bör det vara möjligt att mäta agonist K b värden för effektormedierad selektiv stater av receptorn - det ultimata måttet på agonist partiskhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health Grant GM 69.829.

References: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

  1. Stephenson, R.P.A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
  2. Furchgott, R.F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
  3. Ehlert, F.J., Suga, H., & Griffin, M.T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
  4. Griffin, M.T., Figueroa, K.W., Liller, S., & Ehlert, F.J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
  5. Black, J.W. & Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
  6. Tran, J.A., Chang, A., Matsui, M., & Ehlert, F.J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
  7. Schultz, J., Hamprecht, B., & Daly, J.W. Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
  8. Berridge, M.J., Downes, C.P., & Hanley, M.R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
  9. Kendall, D.A. & Hill, S.J. In Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis, Yamamura, H.I., Ed., Raven Press, 68-87 (1990).
  10. Pulido-Rios, M. et al. In Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology 48, 4.15.11-14.15.29 (2010).
  11. Kenakin, T. In Current Protocols in Pharmacology, Enna, S.J., Ed., John Wiley & Sons, (2001).
  12. Ehlert, F.J., Griffin, M.T., Sawyer, G.W., & Bailon, R.A simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 289, 981-992 (1999).
  13. Burstein, E.S., Spalding, T.A., & Brann, M.R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).

Ask the Author: Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter